野百合碱在5 种肝微粒体中的体外代谢研究

刘 倩， 陈龙龙， 马双成， 张祖艳， 李云华， 钱 勇， 谢天培*

(1. 上海沪丰生物科技有限公司，上海200433;2. 上海诗丹德生物技术有限公司，上海201203;3. 中国食品药品检定研究院，北京100050)

吡咯里西啶生物碱(pyrrolizidine alkaloids，PAs)是自然界广泛分布的天然有毒生物碱，主要分布在紫草科、菊科、豆科和兰科等植物中。分布广泛的吡咯里西啶生物碱可以通过间接的食物污染如谷物、牛奶、蜂蜜或牧草的污染或者直接通过含吡咯里西啶生物碱的传统草药、补剂、茶等对人类或牲畜生命造成极大的毒害［1］，主要表现为肝毒性及明显的致癌、致突变等作用。吡咯里西啶生物碱riddelliine 已被美国卫生部列为“可合理预期的人类致癌物”。Stickel 等［2］进行的流行病学调查表明，在南非、阿富汗、伊朗、牙买加、印度及前苏联等国家，大量肝病的发生与食用含PAs 的食物及草药有关。在中国至少有40 多种常用中药或民间药物含有PAs。 《中国药典》2010 年版一部(含附录)收载了一些明确含有PAs 的药材及其成方制剂，如千里光、款冬花、佩兰、紫草、川贝雪梨膏等，临床应用广泛［3］。PAs 本身没有毒性，毒性主要来自其在体内的代谢产物［4］。代谢产物具有很强的亲电性，能与组织中亲核性的酶、蛋白质、DNA，RNA 结合，引起各种损伤［5］。其中(+ /-)-6，7-二氢-7-羟基-1-羟甲基-5H-吡咯里嗪(DHP，包括DHR、DHH，结构见图1)形成的DNA加合物，是导致肿瘤发生的原因［6］。

野百合碱 (monocrotaline，MCT，结构见图1)是一种具有致突变、致癌作用的肝毒性倒千里光裂碱型吡咯里西啶生物碱［7］，有抗肿瘤、抗胆碱等作用［4］。对其进行代谢研究可以对药理作用的发挥和代谢致毒解毒研究提供依据。Tang［8］等研究发现在未经诱导的大鼠肝微粒体中野百合碱基本未发生代谢。Wang 等［7］发现，野百合碱在用地塞米松诱导的F344 雌性大鼠肝微粒体中的代谢产物—DHP、N-氧化野百合碱的形成速率比未经诱导的肝微粒体高两倍。本实验对野百合碱在不同肝微粒体体系的代谢进行了研究。

图1 DHP，DHR，DHH，野百合碱的结构

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Agilent 1290 超高效液相-G6460 三重串联四极杆质谱联用仪;涡旋振荡器(Vortex-5，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司);离心机(TGL-16C，上海安亭科学仪器厂);超声波清洗仪(KQ5200DB，昆山市超声仪器有限公司);超速冷冻离心机(CP100MX，日本日立公司);高速冷冻离心机(H2050R，湘仪公司);ELGA 超纯水系统;水浴锅。

1.2 试药 野百合碱(上海诗丹德生物技术有限公司，批号152/130304);脱氢野百合碱、野百合碱-N-氧化物、DHP (按文献方法制备［9-14］，HPLC-MS 检测);PBS 缓冲液(corning cellgro 公司，美国);NADPH (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸四钠盐还原型，上海鼎国生物技术有限公司);BCA 蛋白定量试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司);人肝微粒体(美国BD Gentest 公司20 人混合肝微粒体，批号99268);乙腈、甲酸铵、甲酸均为色谱纯;水为超纯水。

1.3 实验动物 雌性F344 大鼠6 只，ICR 小鼠17 只，SD大鼠4 只，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 肝微粒体的制备 雌性F344 大鼠，连续3 d 以75 mg/kg的剂量腹腔注射地塞米松，末次给药2 h 后禁食16 h，脱臼处死，取出肝脏(以下操作均在冰浴上进行)，剪碎，按体积比1 ∶4 比例加入预冷的100 mmol/L Tris-乙酸缓冲液(pH 7.4，含100 mmol/L Kcl，1 mmol/L EDTA)，匀浆，4 ℃，10 000 g 离心20 min，取上清液，4 ℃，100 000 g离心60 min，弃去上清液。沉淀用50 mmol/L Tris-乙酸缓冲液(pH 7.4，含20% 甘油，0.1 mmol/L EDTA)悬浮，分装，部分肝微粒体用BCA 法测定肝微粒体蛋白质量分数，其余放入-80 ℃冰箱保存。测得肝微粒体蛋白为20 mg/mL。F344 大鼠、ICR 小鼠、SD 大鼠肝微粒体除不经地塞米松诱导外，同法制备。

2.2 分析条件

2.2.1 色谱条件Agilent Zorbax Extend C18色谱柱 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm);流动相10 mmol/L 甲酸铵(0.1%甲酸调pH 为3)-乙腈(5 ∶95);体积流量0.4 mL/min;柱温30 ℃;进样量1 μL。

2.2.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描;检测方式为定量分析，MRM ［野百合碱(m/z)326 →120，内标氧化苦参碱(m/z)265→136］;定性分析为全扫描及产物离子扫描;干燥气温度350 ℃;干燥气体积流量5 L/min;雾化器压力45 psi (1 psi =6.895 kPa);鞘气温度400 ℃;鞘气体积流量11 L/min。

2.3 野百合碱的体外代谢体系和处理方法 温孵体系总孵育体积0.5 mL，含肝微粒体、1 mmol/L NADPH 及野百合碱。介质为磷酸缓冲液(PBS)。配置好的温孵液置于37 ℃振荡孵育特定时间后立即取出，用等体积的冷乙腈终止反应。取400 μL 样品溶液，加100 μL 内标氧化苦参碱，涡旋震荡后，10 000 ×g 离心10 min。过滤，LC-MS 检测。

2.4 标准曲线的制备 取不同质量浓度野百合碱甲醇溶液，加到热失活的F344 大鼠肝微粒体悬浮液中，使反应液中野百合碱的最终质量浓度为33.6、84、168、336、504、840、1 680、3 360、5 040、10 080 μg/L。按“野百合碱的体外代谢体系和处理方法”项操作，以野百合碱的质量浓度为横坐标，野百合碱与内标峰氧化苦参碱面积比值为纵坐标计算曲线的回归方程为y =0.007 8x +0.025 3，r2=0.998 9。测得检测下限为2.1 μg/L。野百合碱质谱定量检测(MRM 模式)见图2。

图2 野百合碱质谱定量检测

2.5 回收率和精密度试验 依据标准曲线方法配制3 个不同质量浓度的野百合碱溶液(420、840、1 680 μg/L)用于回收率和日内日间精密度的测定。测得3 个质量浓度的相对回收率分别为98.7%、99.2%和100.9%。3 个质量浓度的日内精密度RSD 分别为2.6%、3.4%、3.0% (n =6)，3 d 的日间精密度RSD 为5.3%、4.8%、4.1% (n=6)。

2.6 肝微粒体蛋白质量浓度对代谢速率的影响 地塞米松诱导的F344 大鼠肝微粒体蛋白质量浓度在0.2 ～2 mg/mL 范围内，野百合碱质量浓度为1 680 μg/L，温孵时间为60 min时，随着肝微粒体蛋白质量浓度的增大，野百合碱代谢速率增大(见图3)。最终选择肝微粒体质量浓度为2 mg/mL。

2.7 温孵时间对野百合碱代谢速率的影响 地塞米松诱导的F344 大鼠肝微粒体质量浓度为2 mg/mL。样品37 ℃孵育0、30、60、90、120 min，LC-MS 检测野百合碱的质量浓度。结果表明在90 min 后，野百合碱质量浓度趋于稳定(见图4)。最终确定孵育时间为90 min。在此条件下野百合碱的代谢率为9.91%。野百合碱代谢率以被代谢的野百合碱的量和加入野百合碱的量的比值进行计算。

图3 肝微粒体蛋白质量浓度对代谢速率的影响

图4 温孵时间对野百合碱代谢率的影响

2.8 不同来源肝微粒体体外代谢率和产物鉴定 在代谢体系中分别加入人、SD 大鼠、F344 大鼠、经地塞米松诱导的F344 大鼠和ICR 小鼠的肝微粒体使蛋白质量浓度为2 mg/mL，野百合碱终浓度为5 μmol/L，37 ℃振荡孵育，90 min取出，按“野百合碱的体外代谢体系和处理方法”项操作，LC-MS 检测。在人、SD 大鼠、F344 大鼠、经地塞米松诱导的F344 大鼠和ICR 小鼠肝微粒体中野百合碱代谢率分别为0.25%、1.01%、5.45%、9.91%和4.25%。在各体系中除检测到m/z 326 的野百合碱外，还检测到m/z 342的准分子离子峰，通过与合成得到的对照品进行质谱对比，确定为野百合碱-N-氧化物。此外，还检测到m/z 136的代谢产物，通过与合成得到的DHP 进行质谱对比，确定为DHP。几种肝微粒体代谢体系中均未检测到脱氢野百合碱。在失活肝微粒体样品体系中只检测到野百合碱，未检测到野百合碱-N-氧化物和DHP。

3 讨论

由于野百合碱的代谢产物——野百合碱-N-氧化物及DHP 的量较低，实验未对其进行测定。在未经诱导的F344大鼠、人、大鼠、小鼠肝微粒体中，野百合碱的代谢率均较低，其中在F344 大鼠、小鼠肝微粒体中的代谢相对较高。经地塞米松诱导的F344 大鼠肝微粒体能提高野百合碱的代谢，文献也报道经地塞米松诱导后的F344 大鼠肝微粒体能增加代谢产物——野百合碱-N-氧化物及DHP 的形成。因此在代谢影响因素实验中采用经地塞米松诱导的F344 大鼠肝微粒体进行。地塞米松是CYP3A4 酶的经典诱导剂，对人及大鼠的CYP3A4/1 均有较强的诱导作用［15］。还有研究表明地塞米松对CYP1A2、2C9、2C19、2D6、2E1 和3A4 6 种同工酶均有诱导作用［16］。可以认为，诱导CYP450 酶能增加野百合碱的代谢，但参与其代谢的亚型还需进行深入研究。

图5 野百合碱-N-氧化物、DHP 子离子扫描

由于人经地塞米松诱导的肝微粒体无法获得，为了进行比较，所以大鼠、小鼠的肝微粒体也没有进行诱导，由于野百合碱的代谢率较低，因此在条件摸索时用代谢率相对较高的经地塞米松诱导的F344 大鼠肝微粒体进行，并且通过与未经诱导的F344 大鼠肝微粒体进行比较，能看出经地塞米松诱导后确实能增加野百合碱的代谢，这为以后研究参与野百合碱代谢的P450 同工酶亚型提供参考依据。

在人、大鼠、小鼠、F344 大鼠肝微粒体体系中均检测到DHP，而DHP 是肝毒性吡咯里西啶生物碱的毒性代谢产物，表明野百合碱在人、SD 大鼠、ICR 小鼠、F344 大鼠体内均有可能引起毒性，形成DNA 加合物。至于哪些酶参与了DHP 的生成，尚需进一步研究。

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