RP-HPLC法同时测定天智颗粒中天麻素、栀子苷、芦丁和黄芩苷

章运典，周里欣，陈洪英

(河南省宛西制药股份有限公司，河南南阳 474500)

天智颗粒用于治疗血管性痴呆的纯中药制剂。主要由天麻、钩藤、槐花、栀子、黄芩、石决明、桑寄生、首乌藤等组成。具有平肝潜阳、补益肝肾、益智安神的功效。用于肝阳上亢中风引起的智能减退、记忆力差、思维迟缓、定向力差、计算力差、理解多误、伴头晕目眩、头痛、烦燥易怒、失眠、口苦咽干、腰膝酸软等轻中度血管性痴呆的证候［1-3］。现执行质量标准中只测定了天麻素的量，为有效地控制产品质量，本研究采用高效液相色谱法同时测定了方中天麻素、栀子苷、芦丁、黄芩苷4种成分的量，所建立的方法简便，准确度高，专属性强，为本制剂提供了较全面的定量分析方法。能更好地控制产品质量，保证临床疗效。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪及其化学工作站，VWD检测器，二元梯度泵，自动进样器，UP超纯水机;BP211D Satorius十万分之一电子天平;HANGPING FA2104V电子天平;KQ-300DE型数控超声波清洗器。

1.2 试剂 甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.3 对照品 天麻素 (批号110807-200205)，栀子苷 (批号110749-201115，纯度99.7%)、芦丁(批号110080-200707，纯度90.5%)、黄芩苷 (批号110857-201016，纯度94.0%)，上述对照品均购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用。

1.4 样品 天智颗粒由河南省宛西制药股份有限公司生产 (批号分别为 20130901，20130902，20130903)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 ZORBAX SB-C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm 5 μm);流动相为乙腈 (A)-0.05%磷酸 (B)，梯度洗脱 (0～7 min，2%A;7～15 min，2% ～15%A;15～30 min，15% ～30%A);体积流量1.0 mL/min;检测波长220 nm。理论板数按天麻素峰计算，应不低于2000。在此条件下，天麻素、栀子苷、芦丁、黄芩苷峰与其他组分能达到较好分离 (见图1)。

图1 天智颗粒中天麻素、栀子苷、芦丁、黄芩苷的色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of gastordine，geniposide，rutin and baicalin contents in Tianzhi Granules

2.2 对照品溶液的制备 分别取经五氧化二磷干燥的天麻素、栀子苷、芦丁和黄芩苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含天麻素、栀子苷、芦丁和黄芩苷分别为0.0454、0.14407、0.15222、0.18753 mg的混合溶液，即得对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备 取本品适量，研细，取约0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min(功率300 W，频率40 kHz)，取出，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性样品溶液制备 按处方比例分别制备不含天麻、栀子、槐花、黄芩的阴性样品，按“2.3”项下供试品溶液的制备方法，制备阴性样品溶液。

2.5 系统专属性试验 分别吸取混合对照品溶液，供试品溶液和阴性样品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按照“2.1”项下的色谱条件进样分析，结果样品与对照品色谱图相同保留时间处有色谱峰，阴性样品在与对照品色谱图相同的保留时间处无相应峰出现，表明处方中其他成分对以上4种成分的测定无干扰 (见图1)。

2.6 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下天麻素、栀子苷、芦丁、黄芩苷混合对照品溶液2、5、10、15、20 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积积分值为纵坐标 (Y)，进样量 (X，μg)为横坐标进行回归计算，得线性方程，各对照品质量与峰面积呈良好的线性关系，结果见表1。

表1 线性回归方程Tab.1 Linear regression equation

2.7 精密度试验 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，按峰面积计算RSD值。天麻素、栀子苷、芦丁、黄芩苷的峰面积RSD分别为0.9%、0.7%、0.6%、0.9%，结果表明，仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验 分别精密吸取同一供试品溶液，室温放置，按“2.1”项下色谱条件分别在0、4、8、12、16、24 h进样测定，记录色谱峰面积，计算，天麻素、栀子苷、芦丁、黄芩苷的RSD分别为1.3%、1.6%、1.5%和1.6%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.9 重复性试验 取同一批样品 (批号20130901)，按“2.3”项下方法分别平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算，天麻素、栀子苷、芦丁、黄芩苷的RSD值分别为1.2%、1.1%、1.4%和1.3%，表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验 取已知含有量 (天麻素2.3 mg/g、栀子苷7.2 mg/g、芦丁7.5 mg/g、黄芩苷10.4 mg/g)的样品 (批号20130901)约0.2 g，共6份，精密称定，分别精密加入50%甲醇配制的混合对照品溶液10 mL(含天麻素、栀子苷、芦丁和黄芩苷分别为 0.0454、0.14407、0.15222、0.18753 mg/mL)，再精密加入50%甲醇40 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液。按“2.1”项下方法进行测定，计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收率试验结果 (n=6)Tab.2 Results of recovery tests(n=6)

2.11 样品测定 取3批样品 (批号130901、130902、130903)，每批3份，按“2.3”项下方法分别制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件对3批样品 (进样量10 μL)进行测定，记录峰面积，外标法计算，数据以表示，测得结果见表3。

3 讨论与小结

3.1 检测波长的选择［4-10］天麻素、栀子苷、芦丁、黄芩苷分别在220、240、257、280 nm处有最大吸收。220 nm下天麻素、栀子苷、芦丁、黄芩苷均有较强的吸收，可以同时检测4种成分，而天麻素在其他波长条件下无吸收，故选择220 nm作为检测波长。既可以满足检测的需要，又简化实验方案。

表3 样品测定结果 (，n=3)Tab.3 Results of content determination(，n=3)

表3 样品测定结果 (，n=3)Tab.3 Results of content determination(，n=3)

批号 天麻素/(mg·g －1)栀子苷/(mg·g －1)芦丁/(mg·g －1)黄芩苷/(mg·g －1)1309012.307±0.0257.200±0.0217.497±0.05110.420±0.0361309022.220±0.0367.270±0.0567.690±0.03610.197±0.0611309032.917±0.0327.510±0.0997.930±0.04611.517±0.065

3.2 提取溶剂、提取方法及提取时间的选择［8-13］实验中比较了回流提取和超声提取两种方法制备供试品溶液，结果测得成分的量无明显差异，由于超声提取法具有效率高、操作简便等优点，所以采取超声提取法;实验中考察了甲醇、稀乙醇、50%甲醇、水等为提取溶剂，结果50%甲醇提取效果较好;考察了超声提取时间20、30、40、60 min，结果超声提取30、40、60 min，提取效率相当，故确定以50%甲醇为提取溶剂，超声提取30 min。

3.3 流动相的选择［8-13］实验中采用梯度洗脱，曾用乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液等作为流动相，并调节流动相的比例，结果以乙腈-0.05%磷酸水溶液为流动相，分离效果好，峰形好，基线较稳定。

3.4 小结 天智颗粒现执行标准［1］中，采用高效液相色谱法，只测定了天麻素的量，而且所用的流动相也单一。中药复方制剂均由多味药组成，其药效是多种活性物质同时发挥而达到治疗效果，故对于单味药的检测是远远不够的，难以控制制剂的内在质量，所以为了更好地控制本产品的质量，本研究采用RP-HPLC法同时测定天智颗粒中天麻素、栀子苷、芦丁和黄芩苷的量，方法简便、结果准确、重复性好，为提升天智颗粒的质量标准提供了科学依据，可用于天智颗粒的质量控制。

［1］YBZ01682004-2008Z，国家食品药品监督管理局国家药品标准［S］.

［2］刘宪平，康 康.天智颗粒治疗轻中度血管性痴呆疗效观察［J］.中国实用神经疾病杂志，2009，12(8):9-11.

［3］杜贵友，朱新成，赵建军，等.天智颗粒治疗老年血管性痴呆临床观察［J］.中国中药杂志，2003，28(1):73-77.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:54，231，282，333.

［5］刘永利，李冬梅，冯 丽，等.RP-HPLC同时测定银黄胶囊中绿原酸与黄芩苷含量［J］.中成药，2006，28(8):1142-1144.

［6］黄燕萍，黄 焜.HPLC法同时测定栀子金花丸中栀子苷和黄岑苷的含量［J］.中国药事，2010，24(10):1002-1004.

［7］李培凡，张韻慧，肖 莉，等.RP-HPLC法测定不同产地槐米中芦丁［J］.中草药，2006，37(9):1419-1420.

［8］程秀民，尘学兰，高彦慧，等.RP-HPLC测定槐米中芦丁和槲皮素含量［J］.中成药，2004，26(8):680-682.

［9］姚 干，何宗玉.HPLC测定芩栀胶囊中黄芩苷和栀子苷的含量［J］.中成药，2006，28(10):1442-1444.

［10］韩凤梅，李 宇，李路军，等.高效液相色谱法测定安宫牛黄丸中栀子苷、黄芩苷和盐酸小檗碱的含量［J］.中国中药杂志，2007，32(14):1406-1408.

［11］高晓燕，卢建秋.栀子金花丸中栀子苷、黄芩苷、番泻苷A和番泻苷B的含量测定方法研究［J］.中国中药杂志，2009，34(20):2649-2651.

［12］师永清，康淑荷，王爱军.HPLC法同时测定导赤丸中栀子苷、芍药苷、黄芩苷和盐酸小檗碱［J］.中成药，2013，35(7):1462-1465.

［13］周 蓬，宋 青，马 帅.HPLC法同时测定小儿豉翘清热颗粒中栀子苷、芍药苷、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素［J］.中成药，2013，35(8):1693-1696.