资冲颗粒对大鼠间充质干细胞生殖分化相关标记基因表达的影响

邓延莉，万 谦，陆 华

(1.成都中医药大学临床医学院，四川成都 610037;2.成都中医药大学第二临床医学院中西医生殖实验室，四川成都 610041;3.成都中医药大学第二临床医学院，四川成都 610041)

间充质干细胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于发育早期中胚层的一类多功能干细胞，MSCs由于它的自我更新和多向分化潜能具有巨大的治疗价值，并日益受到关注。其可在生化诱导剂、细胞生长因子等条件下向各方向分化，成为如肌细胞［1］、成骨细胞［2］、神经细胞［3］等各类细胞。国内研究中越来越多的实验表明，中药有可能干预间充质干细胞向体外的分化［4-6］。

资冲颗粒是根据经典方左、右归丸而研制的一种补肾中药复方。其由熟地、菟丝子等药物组成，功效补肾化瘀、资冲调经。本课题组前期研究发现资冲颗粒能提高去势雌小鼠的雌激素水平［7］及促进大鼠的卵泡发育［8-9］。临床上资冲颗粒常用于促卵泡发育及排卵，疗效较好。但资冲颗粒是否有诱导间充质干细胞体外向生殖细胞方向分化的可能，目前尚未见报道。

本次实验选用大鼠成体间充质干细胞 (RMSC)为模型细胞，资冲颗粒大鼠含药血清为检测样品，最终检测资冲颗粒含药血清干预后RMSC细胞形态、生殖细胞分化相关标记基因和细胞增殖的变化情况，现报道如下:

1 材料

1.1 实验仪器 细胞培养箱 (Thermo公司，3111型);倒置显微镜 (Leica公司，DMI3000B型);酶标仪 (Thermo公司，Multiskan spectrum);定量PCR仪 (Bio-Rad公司，CFX96)。

1.2 细胞、药物与试剂 RMSC购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，资冲颗粒大鼠含药血清由四川省中药研究所提供;α-MEM培养液、胎牛血清、细胞培养用双抗(青霉素和链霉素)、磷酸缓冲液PBS(成都哈里公司);检测试剂 MTT(美国 Sigma公司，M5655);RNA提取试剂盒 (美国 Molecular Research Center公司，TR 118);cDNA合成试剂盒(Fermentas公司，K1632);Sybr Green Qpcr试剂(Roche公司，04913850001)。

2 方法与结果

2.1 含药血清及空白血清的制备 在体质量均一的情况下随机将20只大鼠分成2组:含药血清组组、空白血清组，每组10只，雌雄各半。含药血清组灌服资冲颗粒，给药剂量均为5.0 g/kg，给药容量均为20 mL/kg，空白组大鼠灌服蒸馏水。分别于给药后30、60、90 min眼底静脉丛取血，血液静置2 h，3000 r/min离心10 min，分离各组各不同时间段血清，将每组3个时间段的血清混匀，高效液相色谱 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC)分析血清，过滤除菌备用。

2.2 细胞培养和诱导分化 含10%胎牛血清的α-MEM培养液在5%CO2，37℃条件下培养RMSC，以3×105细胞/孔的量接种于6孔板中。24 h后分别加入终质量分数为4.5%资冲颗粒大鼠含药血清及空白大鼠血清进行连续干预72 h，每天镜下显微观察，在干预24 h后和72 h后进行显微采图。

2.3 生殖细胞分化相关的标记基因的检测 如“2.1”项所述干预六孔板中的大鼠间充质干细胞，72 h后提取相关细胞孔的RNA，并以此RNA为模板立即合成cDNA，-80℃保存。利用Sybr Green Qpcr试剂进行Qpcr实验，检测与生殖细胞分化相关的 Oct4、Stra8、Itga6、Itgb1、Scp3、Gdf9、Zp1、Zp3等8种基因的表达量变化情况，选大鼠β-Actin基因为内参基因。针对上述基因的引物信息如表1。

表1 针对8种标识基因及内参基因的引物信息Tab.1 Primer information of eight marker genes and the reference gene

2.4 细胞增殖情况的检测 将RMSC以2×103细胞/孔的量接种于96孔板中，共接种50孔。24 h后，将50孔细胞平均分成两组 (25孔/组)，两组分别加入终质量分数为4.5%的资冲颗粒大鼠含药血清和空白大鼠血清，连续干预5 d，每天对每个干预条件的5个细胞孔进行MTT法检测，连续测定5 d。

2.6 实验结果

2.6.1 资冲颗粒大鼠含药血清对RMSC形态学的影响 由图1可见，终质量分数为4.5%的资冲颗粒大鼠含药血清干预RMSC过程中，细胞数量增加，细胞呈梭形或多边形，细胞集落多成放射状或网状，细胞逐渐融合，细胞之间界限不清;大鼠空白血清干预过程中，细胞形态类似于资冲颗粒大鼠含药血清的干预情况;两种血清干预之间的细胞形态学变化无明显差异。

图1 资冲颗粒大鼠含药血清对RMSC形态学的影响Fig.1 Effect of the rat drug serum with Zichong Granules on the morphology of RMSC

2.6.2 资冲颗粒大鼠含药血清对RMSC的多个生殖分化标识基因转录表达的影响 由表2可见，与大鼠空白血清比较，资冲颗粒大鼠含药血清显著影响了基因Stra8、Scp3和 Gdf9的转录表达 (P=0.0359、0.0071、0.0227);而对其它基因的表达影响不显著 (P＞0.05)。其中，基因Stra8被下调了56.13%，基因Scp3、Gdf9分别被上调了约3.6倍和9.5倍。

2.6.3 资冲颗粒大鼠含药血清对RMSC细胞增殖的影响 通过Excel的回归分析得到资冲颗粒大鼠含药血清组及空白大鼠血清组的生长速率分别为0.1188和 0.1391(O.D.490 nm/d)。使用 SPSS 13.0软件的协方差法对两组生长速率进行了精确的比较，结果表明两组生长速率没有显著差异(P=0.1074)。由此可见，资冲颗粒大鼠含药血清对RMSC的细胞增殖未有显著影响。

表2 资冲颗粒大鼠含药血清对RMSC的多个生殖分化标识基因转录表达的影响 (n=3)Tab.2 Effect of the rat drug serum with Zichong Granules on the transcriptional expression of several marker genes for reproduction differentiation(n=3)

3 讨论

现代社会不孕不育的发生率呈逐年上升趋势，辅助生殖技术虽在治疗不孕不育症方面的得到了广泛的应用，但对生殖细胞缺乏而导致的不孕不育症束手无策。近年来实验研究表明间充质干细胞在一定条件下有可能向生殖细胞分化［10-12］，但对于利用中药干预细胞分化的报道较少，且未见资冲颗粒相关报道。

从细胞形态和细胞增殖情况两方面表明，资冲颗粒含药血清与空白血清作用相似，在短时间内尚未见其明显毒性。

Qpcr结果发现，含药血清对 Gdf9、Stra8和Scp3的转录表达显著影响。Gdf9及Stra8是雌、雄性生殖细胞分化方向的标记基因［13-14］，在本实验中Gdf9被显著上调而Stra8表达显著下调。资冲颗粒中多含中药熟地、菟丝子等滋阴填精之品，提示资冲颗粒含药血清对女性生殖细胞的发育或在某些环节上有一定促进作用，而对于Stra8基因表达下调的机制则需进一步深入研究。Scp3为减数分裂的标记基因［15］，间充质干细胞向生殖细胞方向分化需Scp3表达上调，本次实验结果表明含药血清干预后的RMSC极有可能启动了细胞减数分裂的进程使其向生殖细胞方向分化。

Oct4蛋白质在维持未分化的胚胎干细胞的自我更新中起关键作用［16］，常被用做未分化细胞的标记，本研究中发现资冲颗粒并未显著影响Oct4的表达，说明资冲颗粒的促分化作用可能并未通过Oct4。Itga6基因和Itgb1基因分别编码整合素α6和整合素β1，而整合素α6和整合素β1是精原干细胞的标记物［17-18］，本研究发现这两种基因的表达未受影响，进一步说明资冲颗粒大鼠含药血清并未诱导细胞向雄性生殖细胞分化。Zp1和Zp3是雌性分化后期的标识基因［19］，本研究发现两者的表达均未受影响，说明向雌性生殖细胞的分化可能还处于初期阶段。

综上所述，资冲颗粒有可能诱导RMSC向雌性生殖细胞方向分化。实验补肾中药资冲颗粒临床上促女性卵泡发育的部分原因可能在于诱导了干细胞向新的雌性生殖细胞分化。

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