RP-HPLC 法同时测定宝咳宁颗粒中4 种成分

周 卿， 杨建文， 郑天宇

(1. 遵义医学院药学院，贵州遵义563003;2. 遵义医学院附属医院药剂科，贵州遵义563003)

宝咳宁颗粒是由黄芩、前胡、枳壳、青黛、麻黄、桑叶等十六味中药组成，主要用于治疗小儿外感风寒、内热停食引起的头痛身烧、咳嗽痰盛、咽喉肿痛、烦躁不安等，属国家中药保护品种。在现行《中国药典》2010 年版中仅收载了高效液相色谱法测定黄芩苷［1-2］。为满足对复杂的中药复方体系的质量控制要求，选择多指标的测定可以有效控制产品的质量［3］，故选取了处方中枳壳、黄芩、青黛、前胡四味药中的代表性成分柚皮苷［4-8］、黄芩苷［9］、靛玉红［10-12］和白花前胡甲素［13-15］作为检测指标，建立了高效液相色谱法同时定量测定的方法。

1 仪器与试药

Agilent 1100 全自动高效液相色谱仪(DAD 检测器)(美国安捷伦公司);KQ-500DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);BT125D十万分之一电子天平(赛多利斯北京有限公司)。

柚皮苷(批号110722-201111)、黄芩苷(批号 110715-201117 )、靛 玉 红 (批 号 110717-200204)、白花前胡甲素 (批号111711-200602)对照品均购自中国药品生物制品检定所;宝咳宁颗粒(规格:2.5g/袋)购自本地药材市场;乙腈、甲醇(色谱纯，百灵威化学有限公司);重蒸馏水;其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 汉邦Dubhe-C18色谱柱 (4.5 mm× 250 mm，5 μm);流动相为乙腈 (A)-0.05%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0 min，22%A;7 min，30%A;12 min，60%A;18 ～20 min，95%A);体积流量为1.0 mL/min;柱温25 ℃;进样量20 μL;柚皮苷、黄芩苷和靛玉红检测波长为280 nm，白花前胡甲素为321 nm。在该色谱条件下，取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液进样分析，结果显示柚皮苷、黄芩苷、靛玉红和白花前胡甲素保留时间分别为6.2、9.2、17.5、19.1 min，样品中其他组分不干扰测定，分离度均大于1.5，理论塔板数以白花前胡甲素计大于6 000，色谱图见图1。

图1 宝咳宁颗粒的色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of Baokening Granules

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 分别精密称取柚皮苷、黄芩苷对照品适量，加甲醇制成质量浓度为10.0 mg/mL、1.0 mg/mL 的对照品溶液;精密称定白花前胡甲素，加甲醇制成质量浓度为1.0 mg/mL 的对照品溶液，并用甲醇稀释制备0.01 mg/mL 的对照品溶液;精密称取靛玉红对照品适量，加丙酮制成质量浓度为1.0 mg/mL 的对照品溶液，置于4 ℃冰箱中保存，待用。

2.2.2 供试品溶液 取宝咳宁颗粒适量，研细，精密称取该药细粉1.0 g，加入60%甲醇定容至50 mL，称定质量，水浴超声 (功率500 W，40 kHz)提取45 min 后，放置室温，加60%甲醇补足失去质量，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜过滤，取滤液20 μL 进样分析。

2.2.3 阴性样品溶液 按处方比例分别制备缺枳壳、黄芩、青黛、前胡药材的阴性样品，依“2.2.2”项下制备阴性样品溶液。

2.3 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项中所配各对照品溶液适量于10 mL 量瓶中，用甲醇稀释并定容，配置系列质量浓度的混合对照品溶液，分别取20 μL 在上述色谱条件下进样分析，以对照品质量浓度(μg/mL)为横坐标(X)，色谱峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归。得柚皮苷回归方程为Y ﹦21.29X +69.63，r ﹦0.999 2;黄芩苷为Y﹦68.88 X+ 203.5，r ﹦0.999 1;靛玉红为Y ﹦27.26 X -0.79，r ﹦0.999 0;百花前胡甲素为Y ﹦1.07 X-3.52，r ﹦0.999 1。

结果表明，柚皮苷在5 ～120 μg/mL，黄芩苷在2 ～60 μg/mL，靛玉红在0.5 ～5.0 μg/mL，白花前胡甲素在10 ～100 ng/mL 范围内，与峰面积呈良好的线性关系。最低检测限以性噪比为3 计算，柚皮苷为50 ng，黄芩苷为50 ng，靛玉红为10 ng，白花前胡甲素为10 ng。

2.4 精密度试验 精密配制含柚皮苷100 μg/mL、黄芩苷40 μg/mL，靛玉红2 μg/mL，白花前胡甲素40 ng/mL 的对照品混合溶液，重复进样6 次，以峰面积计算柚皮苷、黄芩苷、靛玉红和白花前胡甲素的RSD 值分别为0.7%、0.3%、0.6%、1.0%。

2.5 重复性试验 取厂家1 样品制备5 份供试品溶液，在上述色谱条件下测定，结果柚皮苷、黄芩苷、靛玉红和白花前胡甲素的RSD 分别为0.8%、1.2%、1.1%、1.8%。

2.6 稳定性试验 取厂家1 样品制备供试品溶液，置于室温，分别于0、1、2、4、6、8、12、24 h在上述色谱条件下测定，结果柚皮苷、黄芩苷、靛玉红和白花前胡甲素的RSD 分别为0.5%、0.3%、0.9%、1.6%，表明样品中4 种成分在24 h 内稳定。

2.7 加样回收率试验 取厂家2 (批号20140204)宝咳灵颗粒9 份，每份0.50 g，按高、中、低3 种加入量分别精密加入“2.2.1”项下柚皮苷、黄芩苷、靛玉红和白花前胡甲素对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法样制备样品溶液，分别测定，计算回收率，结果见表1。

2.8 样品测定 分别取3 个不同厂家宝咳宁颗粒各3 份，按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，按外标法计算药物中4 种成分的量，结果见表2。- 表示未检出

表1 加样回收率测定结果Tab.1 Results of recovery tests

表2 样品测定结果(n=3)Tab.2 Determination of samples (n=3)

3 讨论

3.1 本实验选用了不同比例的甲醇、乙醇进行比较，实验结果显示采用60%甲醇提取率较高，且样品峰形良好，样品成分提取较完全，故选择60%甲醇作为提取溶剂。实验中还比较了加热回流、索氏提取及超声提取4 种不同的提取方法，结果显示当超声提取45 min 时，所测4 种成分的量明显优于索氏提取4 h，加热回流最低，故采用超声提取方法。

3.2 本实验因同时测定的4 种成分具有不同的极性，采用固定比例的流动相难以一次分离完全，采用梯度洗脱，可在20 min 内同时检出该4 种成分。流动相的选择比较了甲醇-水、甲醇-0.05%H3PO4和乙腈-0.05% H3PO4等多种流动相的分离效果，结果显示采用甲醇-水作为流动相时，各成分峰型较差，拖尾严重，而加入H3PO4后，峰型得到较大改善，且在梯度洗脱中，因采用甲醇作为流动相时，基线漂移较大，后改用乙腈得到改善。

3.3 不同厂家宝咳宁颗粒中4 种成分测定结果显示，只有按照《中国药典》规定检测的黄芩苷含有量较接近，其余3 种成分的量有一定差异，因此在复方中成药的质量控制中，建立多指标的质量控制方法有一定的必要性。

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