经颅磁刺激对脑出血大鼠学习记忆能力及GAP-43表达的影响

张运康，陶连方

·基础研究·

经颅磁刺激对脑出血大鼠学习记忆能力及GAP-43表达的影响

张运康，陶连方

目的：观察经颅磁刺激（TMS）对脑出血大鼠学习记忆能力及GAP-43表达的影响。方法：健康成年雄性SD大鼠40只随机分为正常组、假手术组、模型组及TMS组，各10只；建立脑出血模型；TMS组于造模后24 h开始给予TMS治疗，1次/d，连续治疗14 d；采用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力，免疫组化法检测血肿周围组织GAP-43阳性细胞情况。结果：TMS组大鼠学习记忆能力明显较模型组改善（＜0.01）；TMS组血肿周边GAP-43阳性细胞显著多于模型组（＜0.01）；4组均未见自发性出血及癫痫发作。结论：TMS可改善脑出血大鼠学习记忆能力，TMS治疗后，血肿周围GAP-43表达上调。

脑出血；经颅磁刺激；Morris水迷宫；生长相关因子-43

经颅磁刺激（transcranial magnetic stimulation，TMS）是一项无痛、无创、操作简单且安全可靠的神经电生理技术，目前不仅在运动神经功能完整性诊断中广泛应用，而且还在治疗脑梗死、帕金森病、癫痫及抑郁症等方面均取得了较好的疗效[1,2]，但其在脑出血中运用报道尚少。本研究旨在观察TMS对脑出血大鼠学习记忆能力及血肿周围生长相关因子（growth-associated factor-43，GAP-43）表达的影响，以探讨其可能的作用机制，为临床应用TMS治疗脑出血提供一定的实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 健康雄性成熟SD大鼠40只，购于华中科技大学同济医学院实验动物中心，体质量（220±20）g；大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组及TMS组，每组10只；各组均予以自由饮水及正常喂养。

1.1.2 主要试剂与材料 VII型胶原酶（购于美国sigma公司）；STOELTING TL-2型鼠脑立体定位仪（购于美国 Stoelting公司）；Morris水迷宫，Ethovision系统（购于荷兰Noldus公司）；鼠抗兔免疫组化（DAB）试剂盒（购于北京欣博盛生物科技公司）；兔抗GAP-43抗体（购于武汉博士德生物工程有限公司）；微量进样器、手术剪、手术镊等手术器械（购于上海医疗器械厂）；10%水合氯醛（十堰市人民医院药剂科提供）。

1.2 方法

1.2.1 脑出血模型建立 参照Rosenberg法[3]制作脑出血模型，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后将其固定在鼠脑立体定位仪上，根据《大鼠立体定位图谱》[4]进行苍白球定位：前囟后1.4 mm，中线右侧旁开3.2 mm，钻孔，向下进针5.6 mm，以微量注射器缓慢向右侧苍白球注射含有0.2 U/μL VII型胶原酶的生理盐水2 μL，留针5 min。正常组不做任何处理。假手术组用同样方法钻孔、进针，2 μL无菌生理盐水替代胶原酶注射。模型组与TMS组制作脑出血模型。

1.2.2 TMS治疗 TMS组大鼠于造模24 h后开始用行TMS治疗，固定大鼠头部，线圈水平放于实验大鼠头部上方，线圈中心准确对于右侧头颅中央，刺激频率0.5 Hz，脉冲磁场峰值强度1.44 T，连续刺激60次，每天治疗1次，连续治疗14 d。

1.2.3 学习记忆能力测定 治疗14 d后，采用Morris水迷宫对各组大鼠的空间学习记忆能力进行测试。Morris水迷宫水温控制在（25±2）℃，平台高于逃逸平面2 cm，周围设置在实验时一致。按水池4个象限分别将实验大鼠置入水池，大鼠若在60 s内寻找到目标平台且在平台上停留15 s则将其捞起，取大鼠从象限出发到寻找到目标平台所需的时间，称为逃避潜伏期；若大鼠不能在60 s内寻找到目标平台，由实验者将其引导至平台，停留在平台上15 s后将其捞起，逃避潜伏期记为60 s。依据上述方法每天训练4次，连续训练5 d，用第6天记录的结果评定其空间学习记忆能力。

1.2.4 血肿周围GAP-43蛋白的表达 水迷宫测试结束，处死大鼠，断头取脑后固定于4%多聚甲醛内过夜固定，置入30%蔗糖溶液，待组织沉底后进行切片。每只大鼠脑组织均取同样层面的切片放入3%H2O2溶液中1 h；滴加正常羊血清封闭30 min；滴加一抗后4℃下孵育24 h；再滴加相应二抗工作液，室温下反应30 min，加辣根酶标记卵白素工作液，室温孵育30 min；新鲜配制的DAB显色剂显色，显微镜下控制反应时间；蒸馏水洗涤3次终止反应；常规脱水、透明、封片；于光镜下观察、记录结果及拍照，于200倍镜下，随机取5个视野，计数GAP-43阳性细胞。

1.2.5 不良反应 实验过程中，4组大鼠均未见自发性出血及癫痫发作。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 Morris水迷宫测试结果

表1 各组大鼠逃避潜伏期及GAP-43阳性细胞数比较（±s）

表1 各组大鼠逃避潜伏期及GAP-43阳性细胞数比较（±s）

注：与正常组及假手术组比较组比较，①＜0.05；与模型组比较，②＜0.05

组别 只数 逃避潜伏期/s GAP-43个/视野正常组 10 13.88±0.60 9.40±1.24假手术组 10 14.12±0.43 10.3±0.98模型组 10 34.34±0.67① 17.0±1.12①TMS组 10 23.27±0.71①② 23.65±1.31①②

2.2 血肿周围GAP-43蛋白表达

GAP-43阳性细胞表达主要为神经元胞浆及突起着棕黄色；正常组与假手术组脑组织中仅存在少量GAP-43阳性细胞表达，2组间阳性细胞计数差异无统计学意义（＞0.05）；模型组与 TMS组GAP-43阳性细胞表达明显多于正常组及假手术组（＜0.01）；TMS组GAP-43阳性细胞表达多于模型组（＜0.01），见表1及图1。

图1 免疫组化检测模型组（A）及TMS组（B）GAP-43阳性细胞（光镜，×20）

3 讨论

TMS是1985年由英国的Barker等[5]首创的一种非侵入性的脑科学技术[6]，能直接刺激及诱发神经系统活动，且能通过调节其强度、频率、持续时间与刺激间歇等对中枢神经系统兴奋性产生影响，目前已在神经康复学、临床神经学和精神心理学领域中广泛应用。TMS能易化运动传导通路，可促进皮质功能的重建及突触的生成，进而促进运动功能康复[6]；TMS还能影响脑神经递质的生成，如可促进乙酰胆碱水平的升高，而乙酰胆碱的增加又能促进运动功能的恢复[7]；另外，TMS还能增加局部脑血流量和血流速度，显著改善脑梗死后缺血半暗带，且脑血流量的增加又可促进神经细胞的生长，形成新的轴突及树突[8]。学者们早期从TMS治疗机制分析，认为将其应用于脑出血治疗应持谨慎态度，其主要着眼点是关于TMS运用于脑出血的安全性问题，即是否会引起继发性脑出血与癫痫发作等损伤；近年来认为，TMS在采用常规临床参数与标准情况时不会对神经组织造成损伤和出血，且可减轻脑水肿及保护缺血神经细胞[9]。且本研究中，TMS组大鼠未见自发性出血及癫痫发作。目前关于TMS是否对脑出血有治疗作用，是否在对脑出血后神经修复与重建中起着重要作用，成为一个值得研究的问题。

GAP-43是一种轴突膜蛋白，表达产物主要存在于轴突生长锥质膜面，能通过使生长锥基底部胞浆膜加速扩展来促进轴突生长，在神经细胞发育及再生过程中高水平表达，目前被认为是一种研究神经生长发育与损失修复等神经可塑性的标志物[10]；当脑组织受到损伤后，损伤周围神经细胞GAP-43表达可成倍增加[11]，表现为反应性轴突再生及侧枝出芽，表明在受损神经区域有反应性神经网络重建[12]。脑出血作为临床一种急症，不仅能够促进血肿周围组织释放许多炎性因子而损伤脑组织，还能促进某些神经营养因子的释放而保护脑组织。本实验通过在用胶原酶诱发的脑出血大鼠模型中发现，脑出血后GAP-43表达明显增多，这可能与脑出血后所激发的机体一种自我保护机制有关；运用TMS治疗脑出血大鼠过程中未观察到大鼠有继发性脑出血、癫痫发作等损伤，且TMS组大鼠逃避潜伏期明显较模型组降低，表明TMS可有效改善脑出血大鼠学习记忆能力；同时还发现运用TMS治疗后可见血肿周围GAP-43表达明显较模型组增多。笔者推测TMS对脑组织的保护作用，可能与促进血肿周围神经细胞或神经胶质细胞合成GAP-43有关。但TMS是通过何种途径促进脑出血周围组织GAP-43表达的增加具体机制还未清楚，仍有待进一步的探讨研究。

[1]Naeser M A,Martin P I,Nicholas M,et al. Improved picture naming in chronic aphasia after TMS to part of right Broca's area:an open-protocol study[J].Brain Lang,2005,93:95-105.

[2]Sun W,Fu W,Mao W,et al.Low-frequency repetitive transcranial magnetic stimulation for the treatment of refractory partial epilepsy[J]. Clin EEG Neurosci,2011,42:40-44.

[3]Rosenberg G A,Mun-Bryce S,Wesley M,et al.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats[J].Stroke,1990,21:801-807.

[4]包新民,舒斯云.大鼠立体定位图谱[M].北京:人民卫生出版社,1991,35-36.

[5]Barker AT,Jalinous R,Freeston IL.Noninvasive magnetic stimulation of human motor cortex[J].Lancet,1985,1:1106-1107.

[6]Ogiue-Ikeda M,Kawato S,Ueno S.Acquisition of ischemic tolerance by repetitive transcra-nial magnetic stimulation in the rat hippocampus [J].Brain Res,2005,1037:7-11.

[7]Keevil J G,Cullen M W,Gangnon R,et al. Implications of cardiac risk and low-density lipoprotein cholesterol distributions in the United States for the diagnosis and treatment of dyslipidemia:data from National Health and Nutrition Examination Survey 1999 to 2002 [J]. Circulation,2007,115:1363-1370.

[8]Fujiki M,Kobayashi H,Abe T,et al.Repetitive transcranial magnetic stimulation for protection against delayed neuronal death induced by transient ischemia[J].J Neurosurg,2003,99: 1063-1069.

[9]Trompetto C,Assini A,Buccolieri A,et al. Motor recovery following stroke:a transcranial magnetic stimulation study [J]. Clin Neurophysiol,2000,111:1860-1867.

[10]Ferreira-Gomes J,Adaes S,Sousa RM,et al.Dose-dependent expression of neuronal injury markers during experimental osteoarthritis induced by monoiodoacetate in the rat[J].Mol Pain,2012,8:50-62.

[11]Chakravarthy B,Rashid A,Brown L,et al. Association of Gap-43(neuromodulin)with microtubule-associated protein MAP-2 in neuronal cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2008, 371:679-683.

[12]Gajda M,Adriaensen D,Cichocki T.Development of the innervation of long bones:expression of the growth-associated protein 43[J].Folia Histochem Cytobiol,2000,38:103-110.

R741；R741.05

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.03.025

湖北医学院附属十堰市人民医院老年病科湖北 十堰 441000

2014-03-11

陶连方taolianf@126.com