移植脑源性神经营养因子转染的骨髓间充质干细胞对AD大鼠的影响

赵慧新，赵钢勇，张平

移植脑源性神经营养因子转染的骨髓间充质干细胞对AD大鼠的影响

赵慧新1，赵钢勇2，张平1

目的：研究移植脑源性神经营养因子（BDNF）转染的骨髓间充质干细胞（MSCs）对阿尔茨海默病（AD）大鼠N-甲基-D-天冬氨酸受体1（NMDAR1）及认知功能的影响。方法：将50只SD大鼠随机平均分为正常对照组、假手术组、AD组、MSCs组、BDNF组。正常对照组不予任何处理，其他4组制备AD模型；MSCs组和BDNF组于制模第11天分别注入10 μL（约5×106）MSCs或pIRESneo-EGFP-BDNF转染的MSCs。采用Morris水迷宫测试大鼠学习记忆能力，免疫组化染色法测定NMDAR1水平。结果：MSCs组、BDNF组与AD组比较平均逃避潜伏期（AEL）明显缩短、跨平台次数显著增加；BDNF组较MSCs组改善更显著（＜0.01），NMDAR1水平更高（＜0.01）。结论：BDNF转染骨髓MSCs对AD大鼠的认知有改善作用，且促进海马区NMDAR1的表达。

阿尔茨海默病；N-甲基-D-天冬氨酸受体；骨髓间充质干细胞；脑源性神经营养因子

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是由于胆碱能神经元受损，导致进行性认知障碍和行为损害。虽然目前治疗该病的药物如胆碱能制剂等可缓解症状，但还没有确定的有效逆转认知障碍的药物。N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）是兴奋性氨基酸谷氨酸的特异性受体，是涉及情绪行为、学习记忆等脑功能的关键物质。以往研究结果显示，AD大鼠侧脑室内移植转染脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可改善AD大鼠认知[1]。本实验通过向AD大鼠侧脑室内移植骨髓MSCs及转染BDNF的骨髓MSCs，观察治疗后AD大鼠学习记忆能力改善情况，并测定治疗干预后的AD大鼠海马区NMDAR必需功能亚基NMDAR1的水平[2]，研究移植BDNF转染的骨髓MSCs对AD大鼠NMDAR1及认知功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 2～3周龄健康SD大鼠50只，雌雄不限，体质量80～120 g，由河北医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂和仪器 Aβ25-35（购于美国Sigma公司），质粒pIRESneo-EGFP-BDNF由本实验室构建[3]，NeuroPORTERTM转染试剂（购于美国GTS公司），HRP标记抗兔抗体（购于北京中衫金桥生物技术有限公司），兔抗鼠NMDAR抗体（购于美国Santa Cruz公司）。电转染仪（购于美国Bio-Rad公司），DW2000脑立体定位仪及Morris水迷宫（购于成都泰盟科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 骨髓 MSCs培养及 pIRESneo-EGFP-BDNF质粒转染骨髓MSCs大鼠颈椎脱臼处死后于无菌条件下分离股骨、胫骨，用含10%血清的L-DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养瓶中，置于饱和湿度培养箱（37℃、5%CO2）中培养，换液，细胞生长接近融合时传代培养。pIRESneo-EGFP-BDNF质粒转染骨髓MSCs：取第3或5代骨髓MSCs进行胰酶消化[4]，用含血清培养基终止消化后，500 rpm 离心 5 min，质粒 pIRESneo-EGFP-BDNF电转染（电压280 V，20 ms）后培养48 h，换为15%FBS培养基（含100 μg/mL G418）进行筛选，2～3 d换液，筛选 10～14 d，去除 G418，用含 15% FBSDMEM培养5～7 d，于荧光倒置显微镜下观察转染细胞的形态，见图1。

1.2.2 动物模型制作及分组 50只大鼠随机分为5组：正常对照组、假手术组、AD组、MSCs组、BDNF组，每组各10只。以制备AD模型为制模第1天，正常对照组不予任何处理，其他4组制备AD模型：10%水合氯醛腹腔注射麻醉，于脑立体定位仪上固定头部，暴露顶骨，参照大鼠脑图谱[5]，选择前囟后3.5 mm、中线两侧旁开2 mm为穿刺点，微量注射器垂直进针达硬膜下3 mm（海马CA1区），假手术组注射生理盐水，其他3组均注射Aβ25-35（用生理盐水稀释成2 μg/μL），两侧均为5 μL，注射时间20 min，留针5 min，2次注射间隔10 min。注射完毕后退针，缝合皮肤。MSCs组和BDNF组于制模第11天，定位左侧脑室，于前囟后1.0 mm，中线左侧旁开1.5 mm为穿刺点，垂直进针达硬膜下4.0 mm，MSCs组和BDNF组分别注入10 μL（约5×106）MSCs或pIRESneo-EGFP-BDNF转染的MSCs，注射时间15 min，留针10 min。

1.2.3 学习记忆能力测试 采用Morris水迷宫实验方法测试大鼠学习记忆能力[6]：①定位航行试验：在制模第16天开始，将大鼠面向池壁放入水中，从入水点到发现并爬上水下平台的时间，为逃避潜伏期（escape latency，EL）。连续训练4次，每次间隔60 s，4次EL的平均值为平均逃避潜伏期 （average escape latency，AEL）。②空间探索试验：经过5 d定位航行试验训练，于制模第21天将水下平台移走，大鼠由任一入水点下水，在120 s内通过原水下平台位置的次数为跨平台次数，取4次记录的平均值。

1.2.4 NMDAR1免疫组化检测方法 大鼠学习记忆能力测试后，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，断头取脑，留取含海马的脑段，4%多聚甲醛溶液中固定24～48 h，脱水石蜡包埋，制成5 μm的冠状切片，免疫组织化学染色SP法检测NMDAR1：常规脱蜡和水化，0.3%甲醇-过氧化氢室温孵育，0.01 mol/L枸橼酸缓冲液微波炉内修复，10%山羊血清封闭，加入一抗37℃温箱湿盒孵育30 min，滴加生物素化二抗37℃温箱湿盒孵育15 min，DAB显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，镜下观察。阴性对照用PBS替代一抗，余步骤同上。每只大鼠取3张海马CA1区的NMDAR1免疫组化染色切片，用显微镜目测器对NMDAR1阳性细胞计数，每张切片的每个测定部位随机选5个视野，取平均值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 Morris水迷宫结果

制模第1～5天，与AD组比较，MSCs组、BDNF组AEL有显著性差异（＜0.01）；与MSCs组比较，BDNF组AEL有显著性差异（＜0.01）；制模第1、2天，与假手术组比较，BDNF组AEL有显著性差异（＜0.01）；制模第3～5天，BDNF组与假手术组比较无统计学差异（＞0.05），见图2。与对照组和假手术组比较，AD组和MSCs组跨平台次数有显著性差异（＜0.01），BDNF组差异无统计学意义（＞0.05）；与AD组和MSCs组比较，BDNF组跨平台次数有显著性差异（＜0.01），见图3。

图1 pIRESneo-EGFP-BDNF电转染后的骨髓MSCs（×400）

2.2 NMDAR1免疫组化结果

正常对照组、假手术组、AD组、MSCs组及BDNF组NMDAR1免疫阳性神经细胞数量分别为（30.27±2.98）、（28.43±4.63）、（13.60±2.53）、（22.53± 3.36）、（26.35±2.28）个，与正常对照组比较，AD组、MSCs组、BDNF组有显著性差异（＜0.01）；与假手术组比较，AD组、MSCs组有显著性差异（＜0.01）；与AD组比较，MSCs组、BDNF组有显著性差异（＜0.01）；与MSCs组比较，BDNF组有显著性差异（＜0.01），见图4。.

图2 5组大鼠定位航行试验AEL比较

图3 5组大鼠跨平台次数比较

3 讨论

本实验显示AD组AEL较假手术组及正常对照组均延长，且跨平台次数均减少，有显著性差异（＜0.01），认为AD模型成功。MSCs组及BDNF组大鼠水迷宫实验成绩均好于AD组大鼠，即侧脑室内给予骨髓MSCs及转染BDNF的骨髓MSCs治疗干预后的AD大鼠认知障碍均有改善，且BDNF基因修饰的骨髓MSCs对AD大鼠治疗效果更显著。

BDNF主要分布在海马及大脑皮质[7]，是神经元产生的神经营养因子，不仅促进发育期神经元存活、生长、分化，且调节成年期中枢神经系统突触传递及突触可塑性，改善记忆等认知功能[8]。以往研究证实AD患者BDNF水平下降[9]，且动物实验表明脑室内注射BDNF抗体导致大鼠的空间学习记忆能力下降[10]，因此可否通过给予BDNF改善AD认知障碍成为研究热点。由于BDNF不能透过血脑屏障，因此多采取将BDNF基因转染骨髓MSCs后注入侧脑室进行移植的方法[11]。本实验中BDNF组认知障碍改善最明显，再次证实BDNF可改善AD的认知。具体机制并不明确，近年研究表明BDNF在海马的突触可塑性和记忆中发挥重要作用可能是通过增强NMDAR表达[12]。

NMDAR是一种配体电压双重门控型离子通道受体，为兴奋性氨基酸谷氨酸受体，介导兴奋性突触传递，通过结合谷氨酸使膜两侧钠、钾、钙通透性升高，产生兴奋性突触后电位。NMDAR改善学习记忆能力是通过依赖性长时程增强过程触发下游的蛋白激酶级联反应[13]，影响突触可塑性和行为，有助于神经功能的代偿和恢复。NMDAR与AD有重要的关系[14]。NMDAR包括NMDAR1和NMDAR2两个亚基，NMDAR1为必需功能亚基[2]，故NMDAR1可反映NMDAR水平。本实验显示MSCs组和BDNF组大鼠海马区NMDAR1表达均高于AD组，且认知改善最明显的BDNF组大鼠海马区NMDAR1水平更高，提示移植BDNF转染骨髓MSCs促进AD大鼠NMDAR1的表达，推测BDNF可能通过促进骨髓MSCs的存活及其他机制，最终促使NMDAR1表达上调。该结果同时提示AD大鼠认知障碍的改善可能与海马区NMDAR1表达水平升高有关，且文献报道目前研究较热的合成类促智药物Sunifiram即可能通过NMDAR来改善认知[15]。NMDA过度活化NMDAR也可导致神经元产生毒性损伤[16]。

本实验显示移植BDNF转染骨髓MSCs对AD大鼠的认知有改善作用，且促进海马区NMDAR1的表达，为进一步寻找治疗AD的有效措施提供了理论依据。

图4 正常对照组（A）、假手术组（B）、AD组（C）、MSCs组（D）及BDNF组（E）大鼠NMDAR1免疫阳性神经细胞（免疫组化SP染色，×400）

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Effect of Transplantation of Bone Mesenchymal Stem Cells transfected with BDNF on Alzheimer Disease Rats

Objective:To study the changes of N-methyl-D-aspartate receptor 1 (NMDAR1)and learning and memory function after transplanting bone mesenchymal stem cells (MSCs)modified with brain-derived neurotrophic factor(BDNF)gene in brain of Alzheimer disease(AD)rats models.Methods:Fifty healthy SD rats were randomly divided into 5 groups with equal number in each group,groups normal,sham,AD,MSCs,and BDNF.The normal group had received no treatment;and the AD models were established in the other 4 groups. The MSDs and the BDNF groups were injected by 10 μL (about 5×106)MSCs or MSCs modified with BDNF gene respectively.The learning and memory abilities of the rats were evaluated with Morris water maze test.The expression of NMDAR1 was detected by immunohistochemistry.Results:The average escape latency(AEL)was significantly shorter and the frequency of crossing the platform was significantly increased in the MSCs and BDNF groups compared with those in the AD group.The rats in the BDNF group showed greater learning and memory function improvement and higher expression of NMDAR1 compared with those in the MSCs group(＜0.01).Conclusion:Bone MSCs modified with BDNF gene could improve the memory and learning of AD rats and up-regulate the expression of NMDAR1 in the hippocampus.

Alzheimer disease;N-methyl-D-aspartate receptor;bone mesenchymal stem cells;brain-derived neurotrophic factor

R741;R741.05

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.03.007

1.河北大学附属医院神经内科河北 保定 071000 2.河北大学生物技术研究中心河北 保定 071000

2013-09-17

张平huandeng2004@163. com