他莫昔芬对小胶质细胞氧糖剥夺后迁移和增殖的影响

韩庆东，刘胜文，孙炜，谢蕊繁，雷霆，陈劲草，张华楸

他莫昔芬对小胶质细胞氧糖剥夺后迁移和增殖的影响

韩庆东，刘胜文，孙炜，谢蕊繁，雷霆，陈劲草，张华楸

目的：观察他莫昔芬（TAM）对氧糖剥夺（OGD）模型中小胶质细胞BV-2增殖和迁移的影响。方法：将BV-2细胞分为对照组（常规正常氧浓度+高葡萄糖+无胎牛血清培养基）、OGD组（1%氧浓度+无糖+无血清培养基）、OGD+TAM组（1%氧浓度+无糖+无血清培养基+TAM），采用划痕试验，通过免疫荧光技术检测小胶质细胞BV-2在不同氧浓度下的增殖和迁移情况。同时观察TAM对小胶质细胞活化的调节作用。结果：与对照组相比，BV-2在OGD后细胞迁移加快（＜0.05）；OGD+TAM组迁移较OGD组下降（＜0.05）；OGD组Ki67阳性率的BV-2明显高于对照组（＜0.05）；OGD+TAM组Ki67阳性率则明显低于OGD组（＜0.05）。结论：缺氧可诱导小胶质细胞活化，雌激素受体拮抗剂TAM能有效抑制这种活化。

他莫昔芬；小胶质细胞；迁移；增殖；脑缺血

小胶质细胞作为中枢神经系统内的常驻免疫细胞，参与神经系统疾病的病理生理过程。特别是在缺血性脑血管病中，大量研究显示小胶质细胞的活化（如炎症因子分泌、迁移及增殖等）对神经元的损伤和修复起不可忽视的作用[1-3]。如何调控小胶质细胞的活化，进而降低缺氧后神经元损伤，促进修复，一直是神经科学研究的热点。容积调控阴离子通道（volume regulated anion channels，VRACs）是一种广泛存在于许多细胞表面的阴离子通道，在多种病理生理情况下参与细胞体积的调节[4]。他莫昔芬（Tamoxifen，TAM）是目前常用的一种VRACs阻断剂。本实验通过观测TAM在小胶质细胞氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）后迁移和增殖中的作用，探索TAM在脑缺血性疾病的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 BV-2细胞系，由我院神经内科实验室提供。

1.1.2 主要试剂及设备 TAM（购于美国Sigma公司），大鼠抗小鼠OX-42单克隆抗体及兔抗小鼠Ki67单克隆抗体（购于美国Abcam公司），二抗Cy3标记的山羊抗大鼠IgG、FITC标记的山羊抗兔IgG、4%多聚甲醛、L-多聚赖氨酸、Triton及牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）及DAPI（购于武汉碧云天生物公司），高糖DMEM培养基、无糖DMEM培养基及胎牛血清（购于美国Hyclone公司），0.25%胰蛋白酶（购于武汉基诺生物公司），6孔塑料培养板及24孔培养板（购于美国Corning公司），N2恒温培养箱及CO2恒温培养箱（购于美国Thermo公司），倒置相差显微镜及正置荧光显微镜（购于日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 BV-2细胞系培养 将冻存于－80℃的BV-2细胞系复苏后，分别均匀种植于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基的6孔塑料培养板里（5×105/孔）用于划痕实验检测细胞迁移；将用0.01%多聚赖氨酸包被过的的无菌小圆玻片置于24孔塑料培养板中，将上述BV-2细胞种植于该24孔板中圆玻片上（1×104/孔）。给予TAM干预前，将上述种植于6孔板及24孔板中的BV-2细胞在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培育，置于5%CO2、37℃培养箱24 h，贴壁达80%时进行划痕试验及细胞增殖实验。将BV-2细胞分为3组：对照组（常规正常氧浓度+高葡萄糖+无胎牛血清培养基）、OGD组（1%氧浓度+无糖+无血清培养基）、OGD+TAM组（1%氧浓度+无糖+无血清培养基+TAM）。OGD组和OGD+TAM组进行10 min OGD后，均将无糖无血清DMEM培养基更换为高糖DMEM培养基，OGD+TAM组在OGD时及随后的高糖DMEM培养基再灌注时均给予TAM（10 μg/mL）干预。

1.2.2 划痕实验 依照文献[2,5]，将上述种植于6孔板的BV-2细胞用无菌微量加样器尖头于贴壁于孔底的细胞纵行划痕，并且依据坐标位置划痕位置一致，用PBS各孔轻轻冲洗震荡。3组在OGD及 OGD+TAM组行OGD后10 min后的0、24及48 h（n=5）均倒置相差显微镜拍照，记录划痕后两平行线间围绕的空白面积。

1.2.3 增殖实验 将上述种植于24孔板的BV-2细胞同样分为3组，按前述OGD及再灌注方法将BV-2细胞OGD后再灌注3 h，给予免疫荧光染色，分别以大鼠抗小鼠OX-42单克隆抗体及兔抗小鼠Ki67单克隆抗体双染上述3组细胞（OX-42为BV-2细胞系特异性标志物，核蛋白ki-67标记BV-2增殖），对应二抗Cy3标记的山羊抗大鼠IgG及FITC标记的山羊抗兔IgG，染色完成后于正置荧光显微镜避光拍摄（n=5）。

1.3 统计学处理

利用NIH Image J软件分析划痕结果，采用SPSS19.0统计软件进行数据处理，结果以（±s）表示，检验，＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 划痕实验

划痕后0、24、48 h，BV-2细胞在缺氧后被激活，表现为特征性形态学改变，即细胞体较之前饱满，分支较静息状态下更粗短，倒置相差显微镜下发现BV-2向中间划痕所造成的空白区出现不同程度迁移。48 h后，与对照组比较，OGD组的空白面积明显缩小（＜0.05）；OGD+TAM组划痕形成空白区域面积则较OGD组缩小（＜0.05），见图1。

图1 划痕后0、48 h 3组BV-2细胞的迁移（标尺为200 μm）

2.2 增殖实验

缺氧诱导BV-2增殖，OGD组Ki67阳性率的 BV-2明显高于对照组（＜0.05）；OGD+TAM组Ki67阳性率则明显低于OGD组（＜0.05），见图2，说明TAM可明显抑制BV-2增殖。

图2 3组BV-2细胞系Ki67表达荧光图（A）及直方图（B）（标尺为100 μm）

3 讨论

小胶质细胞占整个脑组织细胞数量的10%左右，分为分支状的静息型小胶质细胞及阿米巴型改变的活化细胞[6,7]。在缺血损伤过程中，小胶质细胞在不同的时间阶段，通过介导免疫炎症反应在神经的损伤和修复中起重要作用[8,9]。小胶质细胞在缺氧后，可发生迁移和增殖，且产生促炎因子。这在小胶质细胞介导的缺氧后炎症损伤起明显作用。TAM作为雌激素受体调控剂，广泛用于乳腺肿瘤的治疗，有研究显示它对脑缺血、外伤及脊髓损伤有一定的神经保护作用[2,10]。近年来发现其能有效抑制胶质细胞和神经元表面VRACs的活化，进而调控兴奋性神经递质（如谷氨酸）的释放，降低缺氧状态下神经元兴奋性损伤。笔者前期的研究表明在大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型中，TAM能有效改善脑缺血导致的神经损伤。其机制可能是通过调控VRACs的活性而发挥作用的。但是其对小胶质细胞活化的影响，及其参与的炎症反应的作用目前尚不明确。本研究基于上述情况，对TAM在缺氧后小胶质细胞活化中的作用展开初步探索。

研究表明，脑缺血、脑损伤后小胶质细胞会因刺激而产生活化，向炎症区域及临近区域可发生多种趋化因子导致的迁移，进而在小胶质细胞激活后产生多种炎症因子，导致神经元损伤[11,12]。TAM对小胶质细胞缺氧后导致的炎症反应可能存在抑制，表现为炎症因子TNF-α、IL-1β等分泌减少。Wang等[1]利用维生素E的类似物—生育酚干预一过性前脑缺血发现，缺血后诱发小胶质细胞向CA1区迁移聚集，进而导致可能的自由基产生而造成神经元的损伤。本研究发现，OGD情况下，与对照组相比，小胶质细胞在施加TAM干预后迁移均出现减弱，说明在OGD情况下，小胶质细胞的迁移明显加强，但TAM可抑制这一过程，进而发挥可能的神经保护作用。对于TAM抑制小胶质细胞迁移的原因，可能因TAM抑制小胶质细胞活化，从而使得缺氧刺激导致的小胶质细胞的迁移减弱有关；而有学者认为抑制小胶质细胞向中枢神经系统炎症反应区域的迁移/趋化，可被视作增加抗炎症反应的作用[13]。

生理状态下，当BV-2细胞系给予不同浓度的TAM后，细胞周期在G0/G1期明显阻滞，而在G2/M期及S期则缩短，呈现出CyclinD1细胞周期蛋白被明显下调，且这一效应表现为时间及浓度的依赖性[14]。对于体外培养的BV-2细胞系在OGD的缺血再灌注模型中，本研究进行进一步探讨。有研究发现，大鼠脊髓半切损伤后，给予细胞周期阻断剂Olomoucine可抑制小胶质细胞的增殖，使相关的炎症反应及组织水肿减轻，起到神经组织的保护作用[15]。在细胞周期阻滞剂应用于小胶质细胞OGD时，表现为细胞周期相关蛋白Cyclin A、Cyclin B和Cyclin E不同程度被抑制，细胞周期的活化被阻滞剂以剂量依赖性的形式阻滞在周期的G1/S和G2/M期，且在动物实验的缺血再灌注模型中也可印证这一现象[16]。TAM抑制小胶质细胞VRACs，影响OGD后小胶质细胞活化，可能通过对细胞周期相关蛋白，诸如CyclinD1等的调节，从而抑制小胶质细胞的增殖；有研究发现，TAM可通过影响MAPK信号通路，实现对小胶质细胞活化的抑制[14]，这一过程包括小胶质细胞迁徙及增殖的抑制。从TAM干预OGD后BV-2小胶质细胞的ki67表达看，其表达较单纯OGD明显下降，细胞增殖被抑制。这也许表明TAM的干预后，OGD诱导的BV-2小胶质细胞增殖被抑制，从而细胞周期受到相应的影响，周期蛋白表达也许被抑制，进而在缺氧条件下减弱由于小胶质细胞被激活增殖而产生的神经系统的损伤。

总之，本研究以文献中的OGD模型构建，将TAM施加于BV-2细胞缺氧再灌注过程中，明确TAM可抑制BV-2细胞迁移及增殖，这可能为研究脑缺血性损伤提供可能的治疗策略。

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Tamoxifen Inhibits the Migration and Activation of Microglia after Oxygen-glucose Deprivation

Objective:To observe the effects of tamoxifen (TAM)on the migration and proliferation of BV-2 cells in oxygen-glucose deprivation(OGD)models.Methods:BV-2 cells were divided into control group(normal oxygen concentration+high glucose+fetal bovine serum free medium),OGD group (1%oxygen+sugar free+ serum-free medium),OGD+TAM group(1%oxygen+sugar free+serum-free medium+TAM).After performing scratch test,migration and proliferation of BV-2 cells were examined by photographs and immunohistochemistry. Results:BV-2 cells in the OGD group shown faster migration than those in the control group (＜0.05).The administration of TAM suppressed the migration of BV-2 cells compared to the OGD group (＜0.05).The percentage of Ki67 positive cells in the OGD group was higher than that in the control group,and the application of Tam reduced the percentage of Ki67 positive cells compared with that in the OGD group(＜0.05).Conclusion: Tamoxifen may play a neuro-protective role in hypoxic condition by suppressing the migration and proliferation of BV-2 cells after OGD.

tamoxifen;microglia;migration;proliferation;cerebral ischemia

R741；R364.4

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.03.003

华中科技大学同济医学院附属同济医院神经外科武汉 430030

国家临床重点专科；国家自然科学基金面上项目（No.81371381）

2014-03-13

张华楸zhanghq_04@yahoo. com