高效液相色谱法测定甜菊糖苷中甜菊醇的含量

胡 林，寇彦杰，翁永京，万小玲

1四川泰华堂制药有限公司，广汉 618300;2 成都华高药业有限公司，成都 610059

甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)为菊科(Composital)斯台比亚属(Stevia)多年生草本植物。甜菊糖苷(steviol glycosides，SGs)是一种从甜叶菊的叶和茎中提取出来的高甜度、低热量天然甜味剂，它主要含九种不同甜味成分［1］，其中甜菊苷(Stevioside)为主要成分，甜菊醇(Steviol)为甜菊苷的苷元，分子具有对映贝壳杉烯型四环二萜骨架结构，具有广泛的生理活性，如清热解毒、抗菌消炎、抗肿瘤等作用［3，4］。本方法采用高效液相色谱法测定甜菊糖苷中甜菊醇的含量，为甜菊糖苷产品质量控制提供科学检测依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1100 高效液相色谱仪(配备在线脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器);CP225D 型电子分析天平(Sartorius 公司);DHG-9140 型电热恒温鼓风干燥箱;KQ-250B 型超声波清洗器。

1.2 材料

甜菊醇对照品(含量100.0%)购自美国ChromaDex 公司;甜菊糖苷样品由成都华高药业有限公司提供;乙腈(色谱纯)购自美国Sigma-Aldrich 公司;乙醇(分析纯)购自广东光华科技股份有限公司;水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Phenomenex C18(4.6 ×250 mm 5 μm;流动相:乙腈-水(50∶50);流速:1.0 mL/min;检测波长:213 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

2.2.1 对照品贮备溶液的制备

精密称取甜菊醇对照品约5.0 mg，置100 mL容量瓶中，加50%乙醇溶液使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备溶液(每1 mL 含甜菊醇50.0 μg)。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密量取甜菊醇对照品贮备溶液适量，加50%乙醇溶液制成1 mL 约含1.0、5.0、12.5、25.0 和50.0 μg 的溶液，即得五个浓度对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取甜菊糖苷约1.0 g，置10 mL 容量瓶中，加50%乙醇溶液约8 mL，超声溶解15 min，放冷稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 测定方法

将“2.2”和“2.3”项下制得的对照品溶液和供试品溶液在高效液相色谱仪上按“2.1”项下测定，记录图谱中甜菊醇的峰面积，见图1。

图1 甜菊醇对照品溶液(A)和甜菊糖苷供试品溶液(B)高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of steviol standard (A)and steviol glycosides (B)

2.5 计算

将“2.4”项下记录甜菊醇对照品的峰面积为横坐标x 轴，以溶液浓度(μg/mL)为纵坐标y 轴，绘制甜菊醇标准曲线，其回归方程y=bx。样品中甜菊醇百分含量按以下公式计算:

式中:%X 为样品中甜菊醇百分含量，A 为样品溶液的甜菊醇峰面积，V 为样品稀释体积10 mL，W为样品的重量g。

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察

甜菊醇在1.046～52.3 μg/mL 浓度范围内色谱峰面积与浓度呈线性关系，线性回归方程为y=0.1795x，相关系数为0.9997。

2.6.2 精密度试验

取同一批供试品溶液，连续进样6 次，每次进样10 μL，记录甜菊醇色谱峰面积，计算峰面积的RSD为0.75%，结果表明仪器的精密度高。

2.6.3 重复性试验

取同一批甜菊糖苷样品6 份，按“2.3”项下“供试品溶液的制备”方法制备并测定，结果甜菊醇质量分数的RSD 为1.25%，相对保留时间的RSD 为0.35%，结果表明方法重复性好。

2.6.4 加标回收率试验

取已知含量的甜菊糖苷样品，精密称定6 份，分别加入甜菊醇对照品约150.0 μg，按“2.3”项下“供试品溶液的制备”方法制备并测定，结果加标平均回收率为96.60%，相对标准偏差RSD 为0.51%(n=6)，表明方法准确可靠、重现性好，见表1。

表1 回收率试验Table 1 Results of recovery tests (n=6)

2.7 样品测定

按上述条件下测定不同等级［2］甜菊糖苷样品中甜菊醇的含量，结果见表2

表2 不同等级甜菊糖苷样品中甜菊醇的含量Table 2 Content of steviol in the different grades of steviol glycosides

3 讨论

在供试品制备过程中分别采用甲醇、乙醇和水的单一溶剂及不同比例混合溶剂作为提取溶剂进行试验，结果表明50%乙醇水溶液提取效果最佳。对超声提取时间进行考察，结果发现15 min 后甜菊醇已经提取完全，考虑到节省样品处理时间，确定提取时间为15 min。对不同等级甜菊糖苷样品中甜菊醇的含量测定结果进行分析发现:样品中甜菊糖苷含量越高甜菊醇含量就越低，表明甜菊糖苷样品经过反复纯化后甜菊醇所占比重降低。迄今为止简单快速、准确定量检测甜菊糖苷中甜菊醇含量的方法国内尚未见报道，本文为甜菊糖苷中甜菊醇含量测定建立了一种可靠的方法。

1 Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives.Specification of steviol glycosides.published in FAO JECFA，2010，Monographs 10.

2 The Peoples’Republic of China National Standard GB 8270-1999(中华人民共和国国家标准).Food Additives，Stevioside(食品添加剂，甜菊糖苷).State Quality and Technical Supervision，1999.

3 Hu YQ(胡艳秋)，Shi H(石浩).Research progress of steviol and its derivatives.Zhejiang Chem Ind(浙江化工)，2011，42:10-14.

4 Mao JL(毛近隆).The progress of steviol in chemical structure modification.J Beijing Union Univ，Nat Sci(北京联合大学学报，自科版)，2011，25:70-74.