平颏海蛇的化学成分研究

姚海萍，梁振纲，杨先会，邓世明

1海南大学热带生物资源教育部重点实验室;2 海南大学海洋学院，海口 570228

平颏海蛇(Lapemis curtus)为眼镜蛇科平颏海蛇属的爬行动物，俗名棘海蛇，国内主要分布于海南、福建、台湾、山东、香港、广西［1］，已被广西中药材标准收载，具有祛风除湿、舒筋活络作用［2］。海南民间常用于泡酒、煲汤治疗各类风湿疾病，效果显著。关于平颏海蛇的化学成分，我国学者雷羽等以青环海蛇和平颏海蛇的混合干体为研究对象，从中提取分离得到胆甾醇、1-甲基海因等4 个化合物。为了研究海蛇药用功效的物质基础及扩大药源，本实验对平颏海蛇干体的化学成分进行了研究，共分离得到7 个化合物，根据理化性质和波谱学方法对其进行了结构鉴定。并利用DPPH 自由基清除实验测定了所得到的单体化合物的抗氧化活性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1H NMR 和13C NMR 由Bruker AM-400 型(TMS为内标)核磁共振谱仪测定。熔点由数字显示显微熔点测定仪测定(X-4，北京泰克仪器有限公司，温度未校正)。Sephadex LH-20 是Pharmacia 公司产品。柱层析硅胶(200～300 目)和薄层色谱硅胶板是青岛海洋化工厂产品，所有试剂均为分析纯。

1.2 样品

平颏海蛇干体4.7 kg，购于海口市东门市场，经海南大学邓世明教授参考中国动物志和广西中药材标准鉴定，凭证标本存放于海南大学海洋学院。

1.3 提取与分离

取平颏海蛇干体(全体)4.7 kg 粉粹，用75%乙醇(15 L)回流提取4 次，经薄层层析检测基本提取完全。提取液减压浓缩(低于55 ℃)回收乙醇得浸膏，将浸膏用适量水溶解后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，分别减压回收溶剂后，得石油醚部分浸膏约136.5 g 和乙酸乙酯部分浸膏约78.0 g，本实验主要对石油醚部分浸膏进行分离纯化。

取石油醚部分浸膏(130 g)，经硅胶干柱层析，石油醚:氯仿:乙酸乙酯(2∶2∶1)洗脱，分为5 个组分:A-E。取A 段，经反复硅胶层析和重结晶得化合物1;B 段经反复硅胶柱层析和Sepadex LH-20(氯仿:甲醇1∶1)，得化合物2～3;E 段经反复硅胶柱层析和Sepadex LH-20(氯仿:甲醇1∶1)，得化合物4～7。

1.4 DPPH 自由基清除试验

用无水乙醇将DPPH 配制成1 ×10-4mol/L 的溶液，置于冰箱中冷藏备用。实验共分3 组，每组总体积为3 mL，第1 组在试管中加入1.0 mL DPPH 溶液(1 ×10-4mol/L)和2 mL 无水乙醇，混匀后在517 nm波长处测吸光度值，记为A0;第2 组加入1.0 mL DPPH 溶液(1 ×10-4mol/L)和2.0 mL 试样，摇匀，在室温下避光反应30 min 后测吸光度值，记为Ai;第3 组加入1.0 mL 无水乙醇和2.0 mL 试样混匀，测定吸光度值记为Aj。每个化合物样品均设置6 个质量浓度:2.0，1.5，1.0，0.8，0.6，0.4 mg/mL，每一吸光度值平行测3 次，取其平均值，按公式:清除率%计算自由基清除率;并求出清除率为50% 时样品的质量浓度(SC50)，样品的活性结果即以半数清除质量浓度(SC50)表示。

2 结构鉴定

化合物1 白色粉末，mp.130～132 ℃，硫酸-乙醇显紫色，易溶于氯仿;1H NMR (CDCl3，400.13 MHz)δ:0.65 (3H，s，H-18)，0.83 (6H，d，J=6.6Hz，H-26，27)，0.88 (3H，d，J=6.5Hz，H-21)，0.98 (3H，s，H-19)，3.49(1H，m，H-3)，5.35 (1H，brs，H-6);13C NMR (CDCl3，100.6 MHz)δ:37.3(C-1)，31.7 (C-2)，71.8 (C-3)，42.4 (C-4)，140.8(C-5)，121.7 (C-6)，31.9 (C-7)，31.9 (C-8)，50.2(C-9)，36.5 (C-10)，21.1 (C-11)，39.8 (C-12)，42.4 (C-13)，56.8 (C-14)，24.3 (C-15)，28.2 (C-16)，56.2 (C-17)，11.8 (C-18)，19.4 (C-19)，35.8(C-20)，18.7 (C-21)，36.2 (C-22)，23.8 (C-23)，39.5 (C-24)，28.0 (C-25)，22.6 (C-26)，22.8 (C-27)。结合NMR 数据及分子量可确定其分子式为:C27H46O;其理化性质、波谱数据与相关文献［3，6］报道的基本一致，故鉴定该化合物为胆甾醇(cholesterol)。

化合物2 白色膏状物，硫酸-乙醇显梅红色，易溶于氯仿;1H NMR (CDCl3，400.13MHz)δ:5.35～5.32 (2H，m)，4.81～4.73 (1H，m)，3.07 (1H，d，J=1.8Hz)，2.25 (2H，t，J=7.56Hz)，2.13～1.59 (9H，m)，1.59～1.29 (48H，m)，1.03 (3H，s)，0.85～0.90 (15H，m)，0.64 (3H，s);13C NMR(CDCl3，100.6 MHz)δ:173.46，129.99，129.73，71.05，63.57，62.53，56.21，56.21，51.00，42.30，39.81，39.50，38.07，36.70，36.15，35.73，35.05，34.60，32.50，31.92，29.76，29.69，29.59，29.52，29.45，29.36，29.31，29.14，29.09，28.14，28.00，27.26，27.22，27.16，25.01，24.19，23.82，22.79，22.68，22.55，21.94，18.68，17.03，14.10，11.76，11.76。结合NMR 数据及分子量可确定其分子式为:C47H82O3;其理化性质、波谱数据与相关文献［4，5］报道的基本一致，故鉴定该化合物为5，6β-Epoxysitosteryl oleate。

化合物3 白色膏状物，硫酸-乙醇显紫色，易溶于氯仿;1H NMR (CDCl3，400.13 MHz)δ:5.34(2H，m，H-9'，10')，5.26 (1H，m，H-2)，4.13 (2H，dd，J=11.9，5.9 Hz，H-3)，4.29 (2H，dd，J=11.9，4.3 Hz，H-1)，2.30 (6H，td，J=7.6，2.3 Hz，H-2'，2''，2''')，2.00 (4H，m，H-8'，11')，1.60 (6H，m，H-3'，3''，3''')，1.25～1.29 (76H，m，H-4'～7'，H-12'～17'，H-4''～17''，H-4'''～17''')，0.88 (9H，t，J=7.0Hz，H-18'，18''，18''');13C NMR (CDCl3，100.6 MHz)δ:173.26 (C-1'，1''')，173.22 (C-1'')，68.86(C-2)，62.08 (C-1，3)，34.21 (C-2'')，34.05 (C-2'，2''')，31.92 (C-8'，11')，29.76～22.68 (nCH2)，14.10 (3CH3)。结合NMR 数据及分子量可确定其分子式为:C57H108O6;其理化性质、波谱数据与相关文献［3，6-8］报道的基本一致，故鉴定该化合物为9-Octadecenoic acid (9Z)-，(2R)-2，3-bis［(1-oxooctadecyl)oxy］propyl ester。

化合物4 白色片状晶体，mp.157～159 ℃，硫酸-乙醇显橙黄色，易溶于氯仿;1H NMR (CDCl3，400.13 MHz)δ:2.91 (3H，s，-CH3)，3.96 (2H，s，-CH2);13C NMR (CDCl3，100.6 MHz)δ:159.4 (C-2)，173.8 (C-4)，53.9 (C-5)，29.3 (C-6)。结合NMR 数据及分子量可确定其分子式为:C4H6N2O2;其理化性质、波谱数据与相关文献［9］报道的基本一致，故鉴定该化合物为1-甲基海因(1-methylhydantoin)。

化合物5 白色膏状物，硫酸-乙醇显紫色，易溶于氯仿;1H NMR (CDCl3，400.13 MHz)δ:4.22(1H，dd，J=11.6，4.6 Hz，H-1'a)，4.19 (1H，dd，J=11.6，6.1 Hz，H-1'b)，3.94(1H，m，H-2')，3.70(1H，dd，J=11.1，4.0 Hz，H-3'a)，3.60 (1H，dd，J=11.5，5.8 Hz，H-3'b)，2.35 (2H，t，J=7.4 Hz，H-2)，1.63 (2H，m，H-3)，1.25 (24H，m，H-4～H-15)，0.87 (3H，t，J=6.6 Hz，H-16);13C NMR (CDCl3，100.6 MHz)δ:70.3 (C-2')，65.2 (C-1')，63.3 (C-3')，34.2 (C-2)，31.9 (C-14)，29.7～29.1 (C-4～C-13)，24.9 (C-3)，22.7 (C-15)，14.1 (C-16)。结合NMR 数据及分子量可确定其分子式为:C19H38O4;以上数据与文献［3，13］报道的基本一致，故鉴定该化合物为α-棕榈酸甘油酯(α-palmityl glycerin ester)。

化合物6 白色粉末，mp.59～62 ℃，硫酸-乙醇显梅红色，易溶于氯仿;1H NMR (CDCl3，400.13 MHz)δ:0.88 (3H，t，J=7.0 Hz)，1.25 (28H，m，H-2～H-15)，1.57 (2H，m)，1.96 (brs，-OH)，3.44～3.56 (4H，m)，3.65 (1H，dd，J=11.39，5.09 Hz)，3.72 (1H，dd，J=11.39，3.87 Hz)，3.85 (1H，brs);13C NMR (CDCl3，100.6 MHz)δ:72.54，71.87，70.39，64.34，31.93，29.69～29.35，26.09，22.69，14.11。结合NMR 数据及分子量可确定其分子式为:C19H40O3;其理化性质、波谱数据与相关文献［5，12，14-16］报道的基本一致，故鉴定该化合物为鲛肝醇(Chimyl alcohol)。

化合物7 白色粉末，硫酸-乙醇显蓝色，易溶于氯仿;1H NMR (CDCl3，400.13 MHz)δ:5.73(1H，brd，J=4.83 Hz，H-6)，3.62 (1H，m，H-3)，0.66 (3H，s，CH3-18)，0.98 (3H，s，CH3-19)，0.92(3H，d，J=6.49 Hz，CH3-21)，0.87 (3H，d，J=1.66 Hz，CH3-26)，0.86 (3H，d，J=1.66 Hz，CH3-27)，0.91 (3H，t，J=6.49 Hz，CH3-29)，3.54 (3H，s，OMe)，3.28 (1H，brt，H-7);13C NMR (CDCl3，100.6 MHz)δ:36.7 (C-1)，39.5 (C-2)，71.5 (C-3)，42.3(C-4)，146.1 (C-5)，120.8 (C-6)，73.9 (C-7)，37.3 (C-8)，42.7(d，C-9)，37.5 (C-10)，20.8 (C-11)，39.1 (C-12)，42.1 (C-13)，49.1 (C-14)，24.3(C-15)，28.2 (C-16)，55.9 (C-17)，11.5 (C-18)，18.3 (C-19)，35.8 (C-20)，18.8 (C-21)，31.5 (C-22)，36.2 (C-23)，35.7 (C-24)，28.0 (C-25)，22.5(C-26)，22.8 (C-27)，23.8 (C-28)，11.9 (C-29)，56.8 (OMe)。结合NMR 数据及分子量可确定其分子式为:C30H52O2;其理化性质、波谱数据与相关文献［11，12］报道的基本一致，故鉴定该化合物为7α-甲氧基-β-谷甾醇(7α-methoxyl-β-sitosterol)。

3 化合物的抗氧化活性

利用DPPH (1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除实验［17］，对从平颏海蛇中分离得到的单体化合物进行抗氧化活性测试，其中化合物1 有极微弱抗氧化活性，SC50值为0.777 mg/mL，阳性对照BHT(2，6-二叔丁基对甲苯酚)的SC50值为0.0217 mg/mL，其他化合物无抗氧化活性，故结果表明各化合物几乎无抗氧化活性。

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