木霉菌KK19L1 发酵液中的一个新化合物

俞 和，王香粉，纪彦南，徐 燕，田沙沙，朱华结

河北大学药物化学与分子诊断重点实验室，河北 071000

木霉(Trichoderma)是一类普遍存在的真菌，常见于土壤中，是土壤微生物的重要群落，从植物根围、叶围、种子及球茎表面，植物残体及腐朽木材上都可以分离到。某些木霉具有活性很强的纤维素酶、几丁质酶等水解酶类，可用于生产纤维素酶和微生物源的糖蛋白以及用于植病生防［1］。绿色木霉、里氏木霉和哈茨木霉由于能够产生多种酶系，对其研究也比较深入［2-5］。木霉中次级代谢产物也比较丰富，刘淑莹等在哈次木霉中分离得到了一系列的蒽醌类化合物［6］，杜林等从海洋木霉中分离得到11个sorbicillinoid 类化合物［7］。为进一步研究木霉菌的次级代谢产物，我们对木霉Trichoderma sp.KK19L1 的代谢产物进行了分离纯化和结构鉴定。

1 仪器与材料

德国BrukerAvance Ⅲ600 MHZ 核磁共振仪(TMS 为内标，δ 为ppm，J 为Hz);高分辨傅里叶变换离子回旋质谱仪(德国Bruker);循环半制备色谱仪(日本岛津公司);Polarimeter Type AA-55 型数字式旋光仪。

Sephadex LH-20(Pharmacia 公司产品);C18 反相填料(北京慧得易科技有限责任公司分装);薄层色谱和正向柱色谱硅胶(青岛海洋化工);薄层硅胶GF254(烟台市化学工业研究所);石油醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、甲醇等有机溶剂均为工业纯经重蒸后使用。

2 实验方法

2.1 菌株的分离、筛选

从河北省保定市河北大学的校园内采集一份土样，在无菌条件下将土样溶于200 mL 无菌水中，震荡使之溶解充分，取上清液进行梯度稀释，浓度依次为原液的10-1～10-9倍。取各个梯度稀释液0.2 mL涂布在PDA 培养基的平板中，待生长出菌落时挑出，在新的平板中培养纯化，最终得到并鉴定为木霉菌(Trichoderma sp.KK19L1)菌株。

2.2 提取与分离纯化

对木霉菌(Trichoderma sp.KK19L1)进行扩大培养，共发酵120 L。过滤、浓缩后得到水相10 L，用乙酸乙酯进行萃取，减压浓缩后得到乙酸乙酯层浸膏20 g，经硅胶(200～300 目)柱层析，二氯甲烷-甲醇(50∶1～1∶1)梯度洗脱，合并相同组分，各组分再经反复硅胶柱层析，Sephadex LH-20 和RP-18 反相柱色谱分离纯化以及C18高效液相制备得:化合物1(17.5 mg)、化合物2(10 mg)、化合物3(7 mg)(图1)。

图1 化合物1～3 的化学结构Fig.1 Chemical structures of 1-3

3 结构鉴定

化合物1 淡黄色粉末，溶于二氯甲烷，分子式为C13H14O3;mp.60 °C;UV(CH2Cl2)λmax347 nm;IR(VCD)νmax1756，1667，1607，1590，1248 cm–1;HR-ESI-MS(positive):m/z ［M+Na］+=241.08336(calcd.for:241.08352)。计算得到不饱和度为7。从13C NMR 和DEPT 谱可以判断化合物有2个甲基，一个连氧的亚甲基，2 个双键上的次甲基，一个2 取代的苯环，2 个羰基，其中一个为酯羰基(172.3 ppm，单位下同)。通过COSY 相关，确定H-3(6.34)、H-4(7.24)、H-5(6.52)、H-6(7.06)依次相连接且为苯环上的氢，由此可断定苯环上为邻位取代。H-2'(6.32)、H-3'(7.08)、H-4'(1.94)依次连接，同时H-3'(7.08)和H-4'(1.94)为双键上的氢。通过HMBC 谱，发现羰基(C-8，197.6)连接C-2(125.0)。同时C-9(27.8)与羰基(C-8，197.6)相连。H-7(4.94)与C-1(125.0)、C-5(128.6)、C-6(147.8)有强相关，且C-6 为季碳，所以确定C-7 与C-6 相连接。C-7 为连氧的亚甲基且H-7(4.94)与C-1'(172.3)有强相关，可确定C-7 与C-1'中间连氧，为酯基结构。其核磁数据及二维相关数据见表1。通过2D NMR(HMQC、HMBC、COSY)数据确定其平面结构为1。通过文献检索发现，该化合物为一新化合物。命名为(E)-3-acetylbenzyl but-2-enoate。其主要二维相关如图2。

图2 化合物1 的主要HMBC 和COSY 相关Fig.2 Key HMBC and COSY correlations of compound 1

表1 化合物1 的核磁数据Table 1 1H NMR，13C NMR and COSY data of compound 1

化合物2 黄色粉末，溶于二氯甲烷，1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:7.27(1H，m，H-2)，7.62(1H，m，H-3)，7.79(1H，m，H-4)，8.27(2H，m，H-5，H-8)，7.09(1H，d，J=7.56 Hz，H-7)，12.54(1H，s，OH);13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:162.8(C-1)，124.2(C-2)，134.4(C-3)，120.0(C-4)，127.3(C-5)，148.6(C-6)，134.1(C-7)，126.8(C-8)，188.0(C-9)，182.6(C-10)，133.6(C-11)，133.1(C-12)，116.1(C-13)，133.3(C-14)，22.2(CH3)。以上波谱数据与文献［7］报道一致，因此鉴定为1-hydroxy-6-Methyl-9，10-anthraquinone。

化合物3 白色针晶，溶于二氯甲烷，1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:12.54(1H，s，OH)，6.36(2H，m，H-6，H-8)，4.62(2H，d，J=6.6 Hz，CH2OH)，3.88(3H，s，OCH3)，3.04(1H，t，J=6.6 Hz，OH)，4.48(3H，s，CH3);13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:164.6(C-2)，118.3(C-3)，182.3(C-4)，104.9(C-4a)，162.1(C-5)，98.1(C-6)，165.6(C-7)，92.3(C-8)，157.7(C-8a)，17.9(CH3)，56.7(CH2OH)，55.8(OCH3)。以上波谱数据与文献［8］报道一致，因此鉴定为5-羟基-3-羟甲基-2-甲基-7-甲氧基色原酮(5-hydroxy-3-hydroxymethyl-2-methyl-7-methoxychromone)，在该木霉菌中首次发现。

1 Zhang CL(章初龙)，Xu T(徐同).Classification research of Trichoderma sp.J Yunnan Agric Univ(云南农业大学学报)，2000，15(3):269-274.

2 HvanJP，MohulatsiM.Biodegration of waste paper by celluase from Trichodermaviride.Bioresource Technology，1996，86:21-23.

3 Korenaga T，Fu S.Separation and enzymatic Saccharificationof cellulose from Wakame.J of Food Composition and Analysis，2000，13:865-871.

4 Altom C，Norvell W，Bjorkman T.Applied and environmental microbiology，1999，65:2926-2933.

5 Estela M，Caryn J，Hussnain A，et al.Degradation of low rank coal by Trichodenmaatroviride ES11.Ind Microbiol Biotechnol，2007，34:625-631.

6 Liu SY(刘淑莹).Study on the anthraquinones separated from the cultivation of Trichoderma harzianum strain Th-R16 and their biological activity.J Agric Food Chem，2009，57:7288-7292.

7 Knut D.Anthraquinones by cyclisation of benzoylbenzoic acids produced by the AlCl3-mediated friedel-crafts reaction of phthalic anhydrides with aromatic compounds.Acta Chemica Scandinavica，1996，50:954-957.

8 Liu T(刘涛)，Li ZL(李占林)，Wang Y(王宇)，et al.The secondary metabolites research of marine fungus Hypocreavirens.J Shenyang Pharm Univ(沈阳药科大学学报)，2012，29(2):93-97.