广东桑根心材的化学成分研究

何细新 ，巢晓娟，杨 璐，张翠仙，皮荣标，曾海祥，李国西，徐玉娟，林燕燕

1广州中医药大学中药学院;2 中山大学药学院，广州 510006

桑属植物具有广泛的药用价值。如桑(Morus abla L.)的枝、叶、果、根皮均可入药，其中桑叶具有疏散风热，清肺润燥，清肝明目功效;桑椹能滋阴补血，生津润燥;桑枝祛风湿，利关节;桑白皮则泻肺平喘，利水消肿［1］。化学成分研究显示，桑属植物富含黄酮类化合物，苯骈呋喃衍生物，生物碱，香豆素，甾体，挥发油等多种成分［2］，具有降血压、抑菌、消炎镇痛，抗癌，抗病毒等多种药理作用［3］。

广东桑Morus atpropurpurea 主要在广东、广西地区广泛栽培。近年来，广东桑的不同部位，如种子［4］，桑枝［5］，根皮［6］的化学成分已有报道。本文对广东桑根心材部分的化学成分进行研究，从中分离得到8 个已知化合物，并对其多酚类化合物进行了抗氧化和神经保护作用研究，为广东桑的资源利用提供科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Brucker 400 MHz 型核磁共振仪;Thremo LCQ DECA XP 质谱分析仪;层析硅胶(200～300 目)，青岛海洋化工厂产;Sephdax LH-20，Merck 公司产品;D101 型阳离子交换树脂，购置于南开大学化工厂;其他所用溶剂均为分析纯;3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，美国Sigma 公司;酶标仪，美国Bio-Tek 公司;分光光度计，美国Varian 公司。

1.2 生物材料

广东桑根于2010 年8 月采自广东湛江，种属由广州中医药大学药用植物教研室鉴定。样品编号为MA2010-ZJ。储藏于广州中医药大学中药学院中药化学实验室，研究所用材料为其心材部分。

1.3 提取与分离

将广东桑根的心材(干重1.3 kg)粉碎后用95%乙醇回流提取3 次，减压浓缩提取液，得棕褐色浓缩物，将浓缩物用200 毫升水悬浮，然后分别以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3 次，乙酸乙酯萃取液浓缩后得浸膏14 g。将此浸膏经硅胶(200～300目)层析分离，以石油醚/乙酸乙酯洗脱。石油醚/乙酸乙酯(体积比6∶4)洗脱部分经Sephadex LH-20，甲醇洗脱得化合物1(15 mg)，2(10 mg)，3(15 mg)，4(100 mg);石油醚/乙酸乙酯(体积比4∶6)洗脱部分，经Sephadex LH-20 进一步分离，甲醇洗脱得化合物5(5 mg)，6(5 mg);乙酸乙酯洗脱部分，经甲醇重结晶得化合物7(10 mg)。正丁醇部分约8 g，经D101 型阳离子交换树脂层析，先以水洗2 个保留体积，然后0.2M 氨水洗脱。氨水洗脱部分，依次经Sephadex LH-20(甲醇洗脱)，硅胶柱层析(200～300目)，从甲醇∶氯仿(体积比4∶6)流份中得化合物8(60 mg)。

2 结果与分析

2.1 结构解析

化合物1 白色固体，ESI-MS m/z:311［M +H］+;1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ 7.32(1H，d，J=8.4 Hz，H-4)，6.88(1H，d，J=1.9 Hz，H-7)，6.83(1H，d，J=0.8 Hz，H-3)，6.78(2H，s，H-2'，6')，6.72(1H，dd，J=8.4，2.1 Hz，H-5)，5.37-5.05(1H，t，J=7.2Hz，H-8')，3.33(2H，d，J=7.2 Hz，H-7')，1.78(3H，s，-CH3)，1.67(3H，s，-CH3);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ157.5(C-3'，5')，157.1(C-6)，156.6(C-8)，156.5(C-2)，131.3(C-9')，130.2(Cl')，124.3(C-8')，123.2(C-9)，121.8(C-4)，116.9(C-4')，113.1(C-5)，103.8(C-2'，6')，101.3(C-3)，98.4(C-7)，26.0(-CH3)，23.3(C-7')，17.9(-CH3)。以上数据与文献［7］报道的Moracin C 的数据一致，将化合物1 鉴定为Moracin C。

化合物2 淡灰色固体，ESI-MS m/z:243［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ 7.34(1H，d，J=8.4 Hz，H-4)，6.91(1H，d，J=2.3Hz，H-6)，6.90(1H，s，H-3)，6.78(2H，d，J=2.2 Hz，H-2'，6')，6.74(1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-5)，6.27(1H，t，J=2.2 Hz，H -4');13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ160.5(C-3'，5')，157.7(C-7a)，157.3(C-6)，156.6(C-2)，134.3(C-1')，123.5(C-3a)，122.5(C-4)，113.7(C-5)，104.5(C-2'，6')，104.1(C-4')，102.7(C-3)，98.9(C-7)。以上数据与文献［8］报道的Moracin M 的数据一致，鉴定化合物2 为Moracin M。

化合物3 无色针状结晶，ESI-MS:m/z 305［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ 7.24(1H，d，J=9.0 Hz，H-6')，6.42-6.34(2H，m，H-3'，5')，5.94(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，5.90(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，5.41(1H，d，J=11.4 Hz，H-2)，4.79(1H，d，J=11.4 Hz，H-3);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ 199.02(C-4)，168.68(C-5)，165.42(C-9)，165.10(C-7)，160.27(C-4')，158.70(C-2')，130.97 (C-6')，115.72 (C-1')，108.08 (C-5')，103.90(C-3')，102.06(C-10)，97.30(C-8)，96.37(C-6)，80.17(C-2)，72.68(C-3)。以上数据与文献［9］报道的二氢桑色素的数据一致，将化合物3 定为二氢桑色素。

化合物4 淡黄色结晶，ESI-MS:m/z 245［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ 7.33(1H，d，J=9.2 Hz，H-6)，7.27(1H，d，J=16.5 Hz，H-α)，6.82(1H，d，J=16.4 Hz，H-β)，6.46(2H，d，J=2.1 Hz，H-2'，6')，6.34-6.31(2H，m，H-3，5)，6.15(1H，t，J=2.2 Hz，H-4);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ158.2(C-3'，5')，157.8(C-2)，155.9(C-4)，140.77(C-1')，127.0(C-α)，125.0(C-β)，123.0(C-6)，116.0(C-1)，106.9(C-5)，104.2(C-2，6)，102.0(C-3)，100.8(C-4')。以上数据与文献［10］报道的氧化白藜芦醇的数据一致，鉴定化合物4 为氧化白藜芦醇。

化合物5 淡黄色针状结晶，ESI-MS m/z:163［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ 7.86(1H，d，J=9.4 Hz)，7.47(1H，d，J=8.5 Hz)，6.81(1H，dd，J=8.5，2.3 Hz)，6.73(1H，d，J=2.2 Hz)，6.20(1H，d，J=9.4 Hz);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:163.7(C-2)，163.1(C-9)，157.3(C-7)，146.0(C-4)，130.7(C-5)，114.5(C-3)，113.2(C-10)，112.4(C-6)，103.4(C-8)。以上数据与文献［11］报道的伞形花内酯的数据一致，鉴定化合物5 为伞形花内酯。

化合物6 灰白色固体，空气中长期放置变黄色粉末结晶。ESI-MS m/z:139［M +H］+;1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ 9.72(1H，s，CHO)，7.51(1H，d，J=8.6 Hz，1H，H-6)，6.46(1H，dd，J=8.6，2.2 Hz，H-5)，6.29(1H，d，J=2.2 Hz，H-3)。以上数据与文献［12］基本一致，鉴定该化合物为2，4-二羟基苯甲醛。

化合物7 白色粉末，TLC 分析与胡萝卜苷标准品Rf值一致，与胡萝卜苷混合熔点不下降，鉴定该化合物为胡萝卜苷［13］。

化合物8 无色油状物，ESI-MS m/z:116［M+H］+;1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ 4.03(1H，dd，J=8.5，6.3 Hz，H-3)，3.41(1H，dt，J=11.5，6.9 Hz，H-4)，3.28(1H，dt，J=11.4，7.3 Hz，H-4)2.32(1H，td，J=15.7，7.4 Hz，H-6)，2.13(1H，td，J=13.3，6.4 Hz，H-6)，2.06-1.94(2H，m，H-5).13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ174.14(C-2)，62.47(C-3)，46.85(C-6)，30.26(C-4)，24.99(C-5)。以上数据与文献一致［14］，鉴定化合物为3-羟基-2-哌啶酮(3-Hydroxy-2-piperidinone)。该化合物首次从桑属植物中得到。

2.2 DPPH 自由基清除率测试

利用DPPH 溶液的特征紫红色团的吸收峰，以分光光度法测定加抗氧化剂后，在517 nm 处吸光度减少值，表示其对有机自由基消除能力［15］。在反应管中加入1 mL 0.2 mM DPPH 的甲醇溶液，再加入1 mL 的化合物1～4 和白藜芦醇终浓度为(2.0，4.0，8.0，16.0 和32.0 μM)，混合均匀，室温避光反应60 min 后在517 nm 处读取吸光度。设1 mL DPPH+1 mL 化合物溶液为实验组，同时以1 mL DPPH+1mL甲醇混合后的吸光度为对照组。计算清除率(%)=［(对照组A517-实验组A517)/对照组A517］×100%。计算使DPPH 溶液吸光度降低50%的化合物浓度(IC50)。将IC50定义为清除50%DPPH 有机自由基的化合物浓度。结果见表1。由结果显示，化合物1～4 都具有自由基清除能力。其中化合物1 和4 对DPPH 自由基清除能力的IC50低于白藜芦醇的IC50，提示它们的清除自由基能力强于白藜芦醇。

表1 化合物抗氧化活性(IC50，μM)Table 1 The antioxidant activity of compounds(IC50，μM)

2.3 HT22 神经元细胞保护活性测试

在96 孔板中种入HT22 细胞(每孔1*104个)，然后加入空白和设定浓度的化合物预处理30 min，再加入空白和L-谷氨酸钠(5 mM)孵化24 h。细胞存活率采用MTT 法测试，活性结果见图1。由结果显示，化合物1，2，3，4 在5 μM 和20 μM 两个浓度下均有一定的神经保护作用。未加L-谷氨酸钠情况下，20 μM 化合物1，2，3，4 降低HT22 细胞活力。L-谷氨酸钠能够造成HT22 细胞死亡，化合物1～4的加入均能减少L-谷氨酸钠诱导的细胞毒性，增加存活率。其中化合物2 在高浓度(20 μM)下活性显著。

图1 化合物1，2，3，4 对L-谷氨酸钠诱导HT22 细胞毒性的影响Fig.1 Effects of compound 1、2、3、4 on L-Glutamate induced cytotoxicity.Cells were grown on 96-well plates(1* 104 cells per well)and pretreated with or without compounds as indicated concentrations for 30 min，and then incubated with or without L-Glutamate(5 mM)for 24 h.Cell viability was measured using the MTT assay.

3 结论与讨论

本研究从广东桑根的心材中分离了8 个已知化合物，经分析将其分别鉴定为桑辛素C(1)，桑辛素M (2)，二氢桑色素(3)，氧化白藜芦醇(4)，2，4-二羟基苯甲醛(5)，伞形花内酯(6)，胡萝卜苷(7)和3-羟基-2-哌啶酮(8)。其中化合物1，3～6 和8 为首次从广东桑Morus atpropurpurea 中分离得到。化合物8 亦首次从桑属植物中分离到。活性研究显示多酚类化合物1～4 均具能清除DPPH 自由基，其中化合物1 和4 的清除能力高于白藜芦醇;均能抑制L-谷氨酸钠诱导海马神经元细胞HT22 毒性，具有神经保护，其中化合物2 在20 μM 浓度下活性显著。

桑属植物具有多种药理活性，包括对心血管系统有降血压作用、提取物在体外有抑菌作用、消炎镇痛作用，还有抗癌抗病毒等药理活性作用。此外，有研究报道［16］桑色素可以诱导肿瘤细胞在S 期中阻滞，从而抑制细胞增殖。本研究采用的永生系小鼠海马神经细胞HT22 是一种可增殖的细胞，化合物1～4 处理24 h 后，HT22 细胞的活力有所降低，可能是由于化合物对细胞产生抑制增殖作用，而不是毒性作用。其抑制细胞增殖的作用机制有待进一步研究。另外，有报道桑色素具有神经保护作用［17］，手术前3 d 给予桑色素(4 mg/kg)可以减少脑缺血再灌注大鼠模型的梗死面积，减少炎性细胞浸润，促进神经功能恢复。本研究发现从广东桑根的心材中分离得到的化合物1、2、3 和4 均可清除自由基，减少由氧化应激引起的神经细胞损伤，这对于广东桑提取物作为抗氧化剂和神经保护剂，应用于神经系统疾病提供了一定的实验依据。但仅是体外实验研究，尚有待更进一步的开展动物水平实验。

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