响应面法优化康定鼠尾草中迷迭香酸提取工艺

迟晓峰，董 琦，胡风祖

中国科学院西北高原生物研究所 中国科学院藏药研究重点实验室，西宁 810008

康定鼠尾草(Salvia prattiiHemsl.)为唇形科鼠尾草属植物，产四川西部、西北部、青海省南部;分布于海拔3750～4000 m 的山坡草地上［1］。迷迭香酸(rosmarinic acid，Ros A 分子式C18H16O8)是由一份子咖啡酸和一分子3，4-二羟基苯基乳酸(即丹参素)的缩合物，为有活性的水溶性的多酚类化合物。迷迭香酸具极强的清除体内自由基的活性和抗氧化作用［2］;抗血栓作用［3］;以及抑制HIV-1 逆转录酶的活性［4］。初步实验发现，康定鼠尾草中迷迭香酸含量较高，有较大开发利用价值，因此，本实验采用响应面分析法对主要因素进行优化，确定较优的提取工艺方法，为大批量生产提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

康定鼠尾草根采自青海省玉树自治州，经中国科学院西北高原生物研究所陈世龙研究员鉴定为唇形科植物康定鼠尾草(Salvia prattiiHemsl.)。迷迭香酸对照品由上海同田生物技术有限公司提供，甲醇为色谱纯和优级纯，H3PO4、无水乙醇，均为分析纯。

美国Waters 515 型高效液相色谱仪:二元梯度泵，Waters 2996 紫外检测器，EMPOWER 色谱工作站;KQ-100E 型超声波清洗器(昆山超声仪器科技有限公司);MOLELEMENT 元素型超纯水机(上海摩勒生物科技有限公司)。

1.2 迷迭香酸的测定

1.2.1 标准溶液的配制

准确称取迷迭香酸标准品2.29 mg，用甲醇溶解，定容于10 mL 的容量瓶，其质量浓度为0.229 mg/mL。

1.2.2 色谱条件

LiChrospher Cl8柱(4.6 mm ×250 mm i.d.，5 μm);流动相:甲醇:水(0.1% H3PO4)=40∶60;紫外检测波长:330 nm;流速:1 mL/min;进样量:10 μL，柱温:30 ℃。

1.2.3 样品测定

分别制备不同的康定鼠尾草供试品，精密吸取10 μL 注入液相色谱仪，测定样品中迷迭香酸的含量，样品和对照品的HPLC 色谱图见图1。

图1 样品与对照品色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance and samples

1.3 单因素实验

在进行响应面分析之前，先通过单因素实验选出对康定鼠尾草中迷迭香酸提取得率具有显著影响的因素，并确定其实验水平。本文考察不同乙醇浓度、液料比、提取时间和提取次数对康定鼠尾草中迷迭香酸提取得率的影响。

2 结果与讨论

2.1 迷迭香酸测定方法学考察

2.1.1 精密度实验

准确吸取混合标准溶液10 μL 重复进样5 次，测得各标准峰面积，计算RSD 值为:0.93%。实验表明，在该条件下精密度良好。

2.1.2 重现性实验

精密吸取同一批样品溶液，进样6 次，测定样品中迷迭香酸的量。测得各峰面积，计算RSD 值为:1.19%。实验表明，迷迭香酸的测定结果重现性良好。

2.1.3 稳定性实验

取同一批供试品溶液，按含量测定法分别在0、4、8、12、24 h 进样，测定样品中迷迭香酸的含量。测定各目的峰面积，计算RSD 为:0.87%。实验表明，供试品溶液24 h 内稳定性良好。

2.1.4 回收率实验

准确称取0.500 g 的样品9 份，取1.2.1 述标准溶液依次加50、100、150 μL 于每3 份样品中，按样品的测定方法提取及测定。以9 次测定的平均值计算回收率分别为:100.3%，RSD 为1.9%。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 乙醇浓度对迷迭香酸提取得率的影响

设定液料比15∶1、超声60 min、温度20 ℃、提取次数为两次的条件下，不同乙醇浓度对迷迭香酸得率的影响。结果表明随着乙醇浓度的提高，迷迭香酸得率呈上升趋势，当乙醇浓度达到40%时迷迭香酸得率最大，之后随着浓度的增加，得率反而降低。因此选择40%左右乙醇浓度作为较佳的提取溶剂。

2.2.2 液料比对迷迭香酸提取得率的影响

设定乙醇浓度40%、超声60 min、温度20 ℃、提取次数为两次的条件下，不同液料比对迷迭香酸得率的影响。结果表明，迷迭香酸得率随着溶剂量的增加而增加，这是由于溶剂用量增加，药材与溶剂接触面增加，有利于扩散速度的提高。在液料比达到15∶1 后，迷迭香酸含量提取得率基本保持不变。由此确定迷迭香酸提取的液料比以15∶1 为宜。

2.2.3 提取时间对迷迭香酸提取得率的影响

设定乙醇浓度40%、液料比15∶1、温度20 ℃、提取次数为两次的条件下，不同超声时间对迷迭香酸得率的影响。结果表明，超声10～50 min 内迷迭香酸得率呈上升趋势，然后随时间的延长含量基本不变。由Fick 扩散定律可知得率与提取时间呈正比，在一定条件下，超声时间越长得率越高;但时间太长会使扩散次数降低，反而影响迷迭香酸的得率，因此，本实验选择超声时间为50 min。

2.2.4 提取次数对迷迭香酸提取得率的影响

设定乙醇浓度40%、液料比为15 ∶1、超声60 min、温度20 ℃的条件下，不同提取次数对迷迭香酸得率的影响。结果表明，提取两次后，迷迭香酸含量提取得率基本保持不变。由此确定迷迭香酸提取的次数以两次为宜。

2.3 响应面实验及其结果

2.3.1 响应面方案设计

根据单因素初筛试验结果，分别确定乙醇浓度、液料比、提取时间为因素，每个因素三个水平进行实验，因素水平表见表1。

表1 Box-Behnken 因素及水平安排表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

2.3.2 响应面分析结果

取康定鼠尾草干燥根，精密称定，由Box-Behnken 设计方案所得的试验条件进行试验，实验结果见表2。

采用Design-Expert7.0 软件对表2 结果进行响应面回归分析，得拟合方程 Y=-77.77817 +0.75745 × X1+0.38609 × X2+1.49770 × X3-0.00075875 × X1 × X2+0.0008375 × X1 × X3-0.0016125 ×X2 ×X3-0.00777042 ×X12-0.00122385×X22-0.094698 ×X32，对该方程的回归分析和方差如表3 所示。

由表3 可以看出，方程的因变量和自变量之间线性关系明显，该模型和失拟项均显著，并且该模型的R2=0.9897，表明该二次回归得到的迷迭香酸提取率模型与实际拟合较好，符合度为98.97%，表明使用该方程模拟实际的三因素三水平的分析是可行的。同时由F 值得大小可以推断，在所选择的实验范围内，3 个因素对迷迭香酸提取率影响的排列顺序为:乙醇浓度(X3)＞提取时间(X2)＞料液比(X1)

表2 Box-Behnken 设计方案及响应值Table 2 Box-Behnken design and response values

表3 回归方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

图2 时间和料液比对迷迭香酸得率的影响Fig.2 Response surface plot showing the effects of extraction time and solid-liquid ratio on extraction yield of rosmarinic acid

图3 时间和乙醇浓度对迷迭香酸得率的影响Fig.3 Response surface plot showing the effects of extraction time and ethanol concentraion on extraction yield of rosmarinic acid

图4 料液比和乙醇浓度对迷迭香酸得率的影响Fig.4 Response surface plot showing the effects of solid-liquid ratio and ethanol concentration on extraction yield of rosmarinic acid

响应面图形是响应值对各因素(X1、X2、X3)所构成的三维空间的曲面图，从图2～4 上可形象地看出各因素交互作用对响应值的影响。比较图2～4可知，乙醇浓度数对迷迭香酸得率的影响最为显著，表现为曲线较陡，乙醇浓度最佳值在40%左右;而时间和料液比次之，表现为曲线较为平滑，其最佳响应值分别在50 min 和15∶1 左右。

2.4 最优条件的确定

通过回归模型预测的迷迭香酸提取的最佳工艺条件为:乙醇浓度38.44%，液固比15.56∶1，时间50.57 min，在此条件下，迷迭香酸理论上可达12.37 mg/g。

考虑到实际操作的可行性，将迷迭香酸的提取条件在回归方程得到的理论值基础上修正为∶乙醇浓度40%，液固比15∶1，提取时间50 min。

3 结论

本实验以康定鼠尾草根为原料，对迷迭香酸进行了超声提取工艺的研究。采用响应面分析法对乙醇浓度、液固比、超声时间进行优化，确定提取溶液为40%乙醇、液固比15∶1、提取50 min，在此条件下迷迭香酸提取效果最佳，迷迭香酸得率可达12.30 mg/g。通过该提取工艺的研究，为工业生产迷迭香酸提取物提供科学的参考依据。

1 Flora of China，Chinese Academy of Sciences Editorial Commission(中国科学院中国植物志编委会).Flora of China(中国植物志).Beijing:Science Press，1977.Vol 66，70-71.

2 Huang ZS(黄治森)，Zhang JT (张均田).Antioxidant properties of three water-solubility components fromSalvia miltiorrhiza.Acta Pham Sin(药学学报)，1992，27:96-100.

3 Petersen M，Simmonds MS.Rosmarinic acid.Phytochemistry，2003，62:121-125.

4 Hooker CW，Lott WB，Harrich D.Inhibitors of human immuno-deficiency virus type 1 reverse transcriptase target distinct phases of early reverse transcription.J Virol，2001，75:3095-3104.