高效液相色谱-蒸发光散射检测器法测定黄连清胃丸中栀子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的含量

夏伊丽 ，李 煌，朱 凤(武警浙江省总队医院药剂科，浙江 嘉兴 314000)

黄连清胃丸是中药复方制剂，处方源自国家药品标准中药成方制剂第九册，由栀子、知母等20 味中药组成，具有清胃泻火的功效，用于口舌生疮、牙龈肿痛、胃热牙痛、暴发火眼等症的治疗［1］。栀子和知母作为方中主要成分，原质量标准中仅对性状进行了控制，未对方中任何药物进行定量检测，为保证药品质量和临床用药安全有效，本文采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)法对栀子中的栀子苷、知母中的知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ进行定量研究，为完善黄连清胃丸质量标准提供依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-10ATVP 型高效液相色谱(HPLC)仪(日本岛津公司生产);Alltech 2000ES 型蒸发光散射器，ANASTAR 色谱数据工作站。

1.2 药品与试剂

栀子苷对照品(批号:110749-201115，含量以99．7%计)、知母皂苷BⅡ对照品(批号:111839-201102，含量以93．2%计)均购自中国食品药品检定研究院;知母皂苷AⅢ对照品(批号:41059-79-4，纯度≥98．0%)购自上海纯优生物科技有限公司;黄连清胃丸(规格:每袋装10 g;批号:130901、130905、130907)购自哈尔滨同一堂药业有限公司;乙腈(色谱纯，天津康科德科技有限公司生产);甲醇(色谱纯，北京益利精细化学品有限公司生产);水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适应性

C18色谱柱(4．6 mm×250 mm，5 μm);乙腈-水(30∶70)为流动相;柱温为室温;流速为0．9 ml/min;ELSD 检测器检测参数:漂移管温度90 ℃，载气(N2)流速2．9 SLPM/min。理论塔板数以知母皂苷AⅢ计算应不低于3 500［2-12］。

2.2 对照品混合溶液的制备

精密称取栀子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ对照品各适量，加50%乙醇制成栀子苷(0．061 8 mg/ml)、知母皂苷AⅢ(0．047 6 mg/ml)和知母皂苷BⅡ(0．184 2 mg/ml)的对照品混合溶液［2-12］。

2.3 供试品溶液的制备

取本品适量，精密称定，研成细粉，精密称取2．0 g，精密加入50%乙醇50 ml，称定质量，超声处理(功率300 W，频率40 KHz)30 min，放冷，再称定质量，用50%乙醇补足减失质量，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液［2-12］。

2.4 阴性对照溶液的制备

按处方比例称取除栀子的其余药味和除知母的其余药味各1 份，按制备工艺分别制成阴性样品，按上述供试品制备方法分别制成缺栀子的阴性对照溶液和缺知母的阴性对照溶液［2-12］。

2.5 线性关系考察

精密吸取对照品混合溶液1、5、10、15、20 μl，按拟定的色谱条件测定，分别以峰面积积分值为纵坐标，栀子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的量为横坐标分别绘制标准曲线，计算回归方程［2-12］。栀子苷回归方程:Y=1．065 7X+5．367 4，r=0．999 2，知母皂苷AⅢ回归方程:Y=1．341 6X+4．357 1，r=0．999 7，知母皂苷BⅡ回归方程:Y=1．268 4X+6．214 1，r=0．9993，结果表明进样量栀子苷在0．061 8～1．236 0 μg、知母皂苷AⅢ在0．047 6～0．952 0 μg、知母皂苷BⅡ在0．184 2～3．684 0 μg 时进样量积分值与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.6 阴性对照试验

精密吸取对照品溶液、供试品溶液、缺栀子的阴性对照溶液及缺知母的阴性对照溶液各10 ul，按上述色谱条件进行色谱分析［2-12］，结果显示供试品溶液色谱中，在与栀子苷、知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅡ对照品相同保留时间处有吸收峰，而阴性对照溶液相同保留时间未显吸收峰，见图1。故认为处方中其他药物对该项含量测定无干扰。

2.7 精密度试验

精密吸取同一个供试品溶液重复进样6 次，按上述色谱条件测定栀子苷、知母皂苷A Ⅲ和知母皂苷B Ⅱ的峰面积［2-12］，结果表明，仪器精密度良好，栀子苷的RSD为0．64%，知母皂苷AⅢ的RSD为0．72%，知母皂苷B Ⅱ的RSD为0．77%。

2.8 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，按上述色谱条件分别于配制后0、1、2、4、6、8 h 精密吸取10 μl，测定其峰面积，考察样品溶液的稳定性［2-12］，结果表明，供试品溶液8 h 内基本稳定，栀子苷的RSD为0．57%，知母皂苷AⅢ的RSD为0．38%，知母皂苷BⅡ的RSD为0．91%。

2.9 重复性试验

取同一批样品，按上述方法制备6 份供试品溶液，分别测定其含量［2-12］，结果表明本方法重复性较好，栀子苷的RSD为0．33%，知母皂苷AⅢ的RSD为0．85%，知母皂苷BⅡ的RSD为0．79%。

2.10 加样回收率试验

取已知含量(栀子苷含量1．56 mg/g，知母皂苷AⅢ含量1．18 mg/g，知母皂苷BⅡ含量4．62 mg/g)的同一批号样品，研细，取1．0 g，精密称定，分别精密加入对照品混合溶液25 ml，再精密加入50%乙醇25 ml，按上述供试品溶液制备方法制成加样供试品溶液。精密吸取加样供试品溶液10 μl，注入HPLC 仪，计算加样回收率［2-12］，结果表明，本法具有良好回收率，见表1。

表1 栀子苷、知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅡ加样回收率试验结果Tab 1 Results of recovery test on Geniposide，Timosaponin AⅢand Timosaponin BⅡ

2.11 样品含量测定

取3 批样品按上述测定方法分别精密吸取对照品混合溶液5、10 μl 和供试品溶液10 μl，注入HPLC 仪测定，用外标两点法对数方程分别测定本品中栀子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的含量，见表2。

表2 样品含量测定结果(n=3)Tab 2 Determination results of contents of samples (n=3)

图1 栀子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的HPLC-ELSDFig 1 HPLC-ELSD of Geniposide，Timosaponin AⅢand Timosaponin BⅡ

3 讨论

实验过程中曾对ELSD 参数进行反复研究，最终确定乙腈-水(30∶70)为流动相，流速为0．9 ml/min，漂移管温度为90 ℃，载气(N2)流速为2．9 SLPM/min。此时样品中栀子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ与其他组分峰可达基线分离，分离度良好，峰型对称。

提取方式的选择考虑到制剂生产时检验的便捷性，采用超声(功率300 W，频率40 kHz)提取进行试验，提取时间分别以20、30、40 min 进行考察，结果30 和40 min 结果相差不大，而提取20 min 时含量明显低于30 和40 min，因此超声提取时间定为30 min。

本方法测定结果准确、灵敏、重复性好，可用于测定黄连清胃丸中栀子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的含量。

［1］ 卫生部药典委员会．中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂［S］．第九册．1998:176．

［2］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典： 一部［S］．2010 年版．北京:中国医药科技出版社，2010:197-198，231-232，附录36-附录38．

［3］ 刘颖，梁洪，祁进，等．龙胆泻肝胶囊及软胶囊质量标准研究［J］．中国中医药信息杂志，2013(10):54-58，59．

［4］ 聂聪珍．高效液相色谱法测定小儿退热合剂中栀子苷的含量［J］．中国医药指南，2013，(14):486-486，487．

［5］ 邱卓星，熊学敏，胡晓艳，等．HPLC 法测定栀子超微速溶饮片中栀子苷的含量［J］．中国医药科学，2013，3(3):116-117，127．

［6］ 李翔，刘皈阳，马建丽，等．HPLC 法测定丹膝颗粒中栀子苷的含量［J］．中国药师，2013，16(3):468-469．

［7］ 胡军波，张红萍．HPLC 法测定清热解毒胶囊中栀子苷的含量［J］．海峡药学，2013，25(2):44-46．

［8］ 王子雯，唐灿，孙嘉婧，等．多指标综合评判巴中产栀子的采收期和生长期［J］．药物分析杂志，2012，32(9):1554-1558，1563．

［9］ 倪文澎，朱敏，周琴妹．HPLC-ELSD 法测定滋肾通关胶囊中2 种知母皂苷类成分［J］．江苏中医药，2012，44(11):69-70．

［10］ 王贵金，裴彩云，贾继明，等．HPLC-ELSD 法测定周络通胶囊中知母皂苷BⅡ［J］．药物评价研究，2011，34(3):187-189．

［11］ 赵兵，陈千良，倪士峰，等．栽培西陵知母中菝葜皂苷元含量动态研究［J］．辽宁中医药大学学报，2011，13(3):22-24．

［12］ 钟可，王文全，靳风云，等．HPLC-ELSD 法同时测定河北产道地药材不同物候期知母中知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的含量［J］．中华中医药杂志( 原中国医药学报) ，2013，28(6):1710-1713．