高效液相色谱法测定地锦喷雾剂中芦丁、槲皮素和山柰酚的含量Δ

巩 伟 ，赵庆华，李兴东，王 莉，张 琨，李 鹏(济南军区联勤部药品仪器检验所，济南 250022)

地锦喷雾剂为济南军区医疗机构制剂［济制字(2011)F10675］，具有清湿热、解毒、止痛、止痒之功效，常用于治疗皮肤、黏膜、腔道炎症、疱疹等，临床效果较好。该制剂由地锦草、丁香、紫花地丁、白鲜皮等组成，处方中，地锦草为君药。众所周知，地锦草具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗过敏等多种作用，其化学成分有黄酮、三萜、香豆素、甾醇、鞣质及酚酸类等化合物，其中以芦丁、槲皮素、山柰酚等为代表的黄酮类化合物为主要活性成分［1-3］。该制剂质量标准中有性状、鉴别、检查等检验项目，无含量测定。为更有效地控制该制剂的质量，本试验采用高效液相色谱(HPLC)法测定地锦喷雾剂中芦丁、槲皮素和山柰酚的含量，报道如下。

1 材料

1.1 仪器

LC-20AT HPLC 仪(包括SPD-20A UV/VIS 检测器，自动进样器，日本岛津公司生产);AUW220D 电子分析天平(日本岛津公司生产);AS-3120A 超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司生产，功率250 W，频率40 kHz);Synergy-UV 超纯水器(法国Millipore 公司生产)。

1.2 药品与试剂

芦丁对照品(中国食品药品检定研究院提供，批号:100080-200707，供HPLC 法测定时含量按90．5%计算)、槲皮素对照品(中国食品药品检定研究院提供，批号:100081-200907，供HPLC 法测定时含量按96．5%计算)、山柰酚对照品(中国食品药品检定研究院提供，批号:110861-200808，供HPLC 法测定时含量按95．9%计算);甲醇、磷酸均为色谱纯(国药集团化学试剂有限公司生产)，水为超纯水(自制)，其他试剂均为分析纯。地锦喷雾剂为2013 年本所抽验制剂品种(批号:20120926、20121106、20121225)。

图1 HPLC 图Fig 1 HPLC chromatograms

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:INTERSIL ODS3(250 mm×4．6 mm，5 μm);流动相:甲醇-0．3%磷酸(50∶50)，体积流量:1．0 ml/min;检测波长:360 nm;柱温:30 ℃;自动进样器进样，进样量:10 μl;理论板数按槲皮素峰计应不低于4 000。色谱图见图1。

2.2 对照品混合溶液的制备

精密称取芦丁对照品10．79 mg，置10 ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成质量浓度为976．495 μg/ml 的芦丁对照品贮备液;精密称取槲皮素对照品10．24 mg、山柰酚9．50 mg，同法制成质量浓度为988．160 μg/ml 的槲皮素对照品贮备液和质量浓度为911．050 μg/ml 的山柰酚对照品贮备液。精密量取上述3 种对照品贮备液各2 ml，置50 ml 量瓶中，加甲醇制成混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取精密吸取地锦喷雾剂内容物10 ml，置25 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.4 线性关系考察

精密量取“2．2”项下的混合对照品溶液各0．5、1．0、2．0、5．0、8．0、10．0 ml，分别置10 ml 量瓶中，加甲醇制成不同质量浓度的混合对照品溶液。取上述对照品混合溶液各10 μl，注入HPLC 仪，记录峰面积。以质量浓度(μg/ml)为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得芦丁的回归方程为Y=39 450X-4 007(R2= 1，n= 6)，槲皮素的回归方程为Y=84 789X-15 125(R2=1，n=6)，山柰酚的回归方程为Y=82 904X-14 602(R2=1，n=6)，表明芦丁质量浓度在1．953～39．060 μg/ml 范围内线性关系良好，槲皮素质量浓度在1．976～39．526 μg/ml 范围内线性关系良好，山柰酚质量浓度在1．822～36．442 μg/ml 范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取同一对照品溶液，进样量为10 μl，连续进样6 次。结果表明，芦丁、槲皮素和山柰酚峰面积的RSD分别为0．41%、0．52%和0．48%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取地锦喷雾剂(批号:20120926)内容物10 ml，按“2．3”项下方法制备，平行试验6 份。结果芦丁的平均含量为37．190 μg/ml，RSD=0．58% (n=6);槲皮素的平均含量为38．536 μg/ml，RSD=0．91% (n=6);山柰酚的平均含量为35．005 μg/ml，RSD=0．41% (n=6)，表明方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液(批号:20120926)10 μl，于0、2、4、8、12、24 h 分别测定峰面积。结果显示，芦丁、槲皮素、山柰酚峰面积的RSD分别为0．87%、1．07%、1．21%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验

精密量取已知含量的样品(批号:20120926)9 份，每份5 ml，置25 ml 量瓶中，分别精密加入“2．2”项下的混合对照品溶液(芦 丁:39．060 μg/ml，槲 皮 素:39．526 μg/ml，山 柰 酚:36．442 μg/ml)各4、5、6 ml，按“2．3”项下方法制备，测定峰面积并计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=9)Tab 1 Results of recovery tests (n=9)

2.9 样品含量测定

取3 个批号的地锦喷雾剂内容物，按“2．3”项下方法制备，分别精密吸取供试品溶液各10 μl，注入HPLC 仪，测定，计算含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果(n=3)Tab 2 Results of content determination of samples (n=3)

3 讨论

本制剂处方中，地锦草为君药，其主要有效活性成分为以芦丁、槲皮素和山柰酚为代表的黄酮类化合物。结合《中华人民共和国药典》中地锦草的含量测定方法［4］和文献报道［5-6］，本试验采用HPLC 法测定芦丁、槲皮素和山柰酚的含量，并用三者的总含量来表示制剂中黄酮类化合物的含量。本试验测定的3 个批号样品中，3 种黄酮类成分的总含量均在110 μg/ml左右，这为地锦喷雾剂的含量限度的确定提供了数据支持。下一步需要进一步扩大试验，从而确定该制剂中总黄酮的含量限度。

选择测定波长时，用二极管阵列检测器扫描色谱图，发现黄酮类成分在测定波长为360 nm 时峰形和分离度均良好，选用360 nm 为测定波长。

选择流动相时，对比考察了乙腈-0．2%醋酸溶液(50∶50)、甲醇-0．3%磷酸溶液(50∶50)、甲醇-0．3%磷酸溶液(40∶60)等3 种流动相，并考察了梯度洗脱模式。结果表明，选择甲醇-0．3%磷酸溶液(50∶50)为流动相时目标成分的响应值好，峰形良好，理论板数、分离度、拖尾因子等均符合要求，且目标成分的保留时间合适。

本试验选用了不同厂家的色谱柱进行比较:SHIMADZU VP-ODS 色谱(150 mm × 4．6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX Extend C18(4．6 mm ×150 mm，5 μm)、Kromasil KR100-5-C18(4．6 mm × 150 mm，5 μm)以及Inertsil ODS-3(250 mm ×4．6 mm，5 μm)。结果显示Inertsil ODS-3(250 mm ×4．6 mm，5 μm)色谱柱响应值最好，样品各组分分离度好，故选用其进行方法学考察和样品含量测定。

［1］ 安惠霞，李治建，古丽娜·达吾提，等．地锦草的研究进展［J］．时珍国医国药，2008，19(12):2866-2868．

［2］ Yoshida T，Amakura Y，Liu YZ，et al．Tannins and related polyphenols of euphorbiaceous plants．XI．Three new hydrolyzable tannins and a polyphenolglucoside from Euphorbia humifusa［J］．Chem Pharm Bull(Tokyo)，1994，42(9):1803-1807．

［3］ Deng F，Tang N，Xu J，et al．New alpha-pyrrolidinonoids and glycosides from Euphorbia humifusa［J］．J Asian Nat Prod Res，2008，10(5-6):531-539．

［4］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典： 一部［S］．2010 年版．北京:中国医药科技出版社，2010:118．

［5］ 雷鹏，刘韶，李新中，等．HPLC 测定地锦草中槲皮素、山柰素的含量［J］．中药材，2005，28(8):666-667．

［6］ 李慧，许亮，徐保利，等．HPLC 测定地锦草中没食子酸、槲皮素及山柰素含量［J］．中国实验方剂学杂志，2012，18(7):100-102．