血红素氧合酶-2基因真核表达载体的构建

张腾业，王珍珍，陈仁金，袁红花，胡安康，吴连连，朱裕华，冀德君，朱孝荣＊

（1.徐州医学院 神 经生物研究中心，江苏 徐 州221004；2.徐州医学院 实 验动物中心，江苏 徐 州221004；3.扬州大学 动 科学院，江苏 扬 州221005）

血红素氧合酶（HO）是血红素降解的限速酶，能将血红素转变为气态信号分子CO和抗氧化剂胆红素和铁［1］，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用，主要分布于神经细胞和内皮细胞中。血红素氧合酶-2（HO-2）是一种结构型血红素氧合酶，是生理状态下HO的主要存在形式，主要起催化作用。随着对HO-2逐渐深入研究，其生物特性和作用机制逐渐被发现。

研究表明HO-2上调HO-1的表达，并对HO-1功能发挥起重要作用［2-3］。在体外试验中，小鼠大脑血管内皮细胞中HO-2基因的缺失能够诱导细胞调亡［4］，此外HO-2也是急性炎症反应修复中的一种关键酶，对抗氧化应激和细胞凋亡有拮抗作用。而TLR4是Toll样受体家族的成员的一种，当TLR4受到刺激后能引起下游的MyD88、NF-k B等的改变，调节炎症反应和细胞凋亡［5］，TLR4缺失时能减少炎症递质的释放及细胞凋亡［6］。由此我们推测HO-2可能通过调节TLR4通路调控细胞炎症反应和凋亡。因此构建了它的真核表达载体，为后续的试验工作做准备。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试剂

C57BL／6小鼠由徐州医学院实验动物中心提供。真核表达载体p EF1α-IRES-AcGFP、小鼠脑血管内皮细胞由徐州医学院神经生物学研究中心保存，限制性内切酶EcoR I和Bam H I、Taq酶、T4 DNA 连 接 酶、SYBR®Premix Ex TaqTM（Tli RNase H Plus）、DH5α感受态细胞、反转录试剂盒及TRIzol试剂，均购自Ta KaRa公司；质粒提取试剂盒，Promega公司生产；凝胶回收试剂盒、Dnase I，Invitrogen公司生产；HO-2多克隆抗体（Abcam公司）、β-actin单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology），羊抗鼠和羊抗兔的荧光二抗（Santa Cruz Biotechnology）；Odyssey扫描仪（Gene），LightCycler 480 System实时PCR仪 （Roche）；Amaxa 2型-Nucleofector仪（Lonza）。

1.2 p EF1α-HO-2-AcGFP真核表达载体的构建

提取C57BL／6小鼠海马组织总RNA，用TaKa-Ra反转录试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，以F：5＇-GTGAATTCATGTCTTCAGAGGTGGAGACC（EcoR I）-3＇，R：5＇-TAGGATCCCATGTAGTACCAGGCCAATAG （Bam H I）-3＇为上下游引物扩增HO-2基因，扩增条件：94℃4 min，94℃40 s，60℃40 s，72℃40 s，72℃10 min，30个循环。扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳，以确定扩增产物大小，然后将HO-2的PCR产物经回收纯化后连接载体p EF1α-IRESAcGFP同时用EcoR I和Bam H I双酶切，酶切后进行1%琼脂糖凝胶电泳，并回收两者的酶切产物，将产物按照3：1的摩尔比混合，用T4 DNA连接酶37℃连接24 h，转化DH5α感受态细胞，然后进行阳性克隆的筛选，提取阳性菌质粒进行酶切鉴定，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.3 重组载体细胞转染

从液氮中取出冻存的小鼠脑血管内皮细胞，37℃水浴复苏，传于细胞培养瓶内，在5%CO2、37℃培养箱中培养，每2 d更换一次培养基（10%FBS的DMEM培养基）。对数生长期的细胞传代培养；细胞单层融合度达70%～80%时，用电穿孔转染法将重组载体p EF1α-HO-2-AcGFP和空载体pEF1α-IRES-AcGFP转入细胞。电转染条件：一个电转杯中载体4μg，总体积200μL，T005模式下电击一次。电击完成后，将电转杯置于恒温培养箱中8～12 min，以使核酸充分进入细胞，然后将电转杯从恒温培养箱中取出，接种细胞悬液于预热的培养基中，上下吹打均匀后，置于培养箱中正常培养。正常培养4 h，待细胞贴壁后，给细胞换新鲜的完全培养基。

1.4 q-PCR检测HO-2基因在m RNA水平的表达

电转染48 h后，收集重组载体和空载体转染的小鼠脑血管内皮细胞，严格按照TRIzol Reagent说明书进行RNA抽提。取1μg的RNA按照TaKa-Ra公司Prime Script®RT Master Mix Perfect Peal Time反转录试剂盒提供的方法合成cDNA。然后以cDNA为模板，用罗氏LightCycler®480 System实时定量PCR。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，F：TACTTCACATACTCAGCCCT，R：ATGGGCCACCAGCAGCTCTG。定量PCR的体系为：2×SYBR®Premix Ex Taq TM（Tli RNase H Plus）10μL，上下游引物各0.4μL，cDNA模板1μL，d H2O配成20μL总体系。反应条件：95℃30 sec，95℃5 sec，60℃20 sec，65℃15 sec，40次循环。以2-△△ct法度量HO-2基因的m RNA的相对表达量，以β-actin基因进行标准化校准。

1.5 Western blot检测HO-2基因在蛋白水平的表达

取重组载体和空载体转染48 h后的细胞提取蛋白，取80μg蛋白上样量，80 V电压下10%SDSPAGE凝胶电泳，等条带到达浓缩胶与分离胶接触面时换成100 V电泳100 min，然后用半干电转仪40 m A恒流转45 min将胶上蛋白转移到NC膜上，转膜完成后用5%的脱脂奶粉封闭2 h。然后与1∶1000稀释的HO-2一抗（兔的多克隆抗体）和1∶1000稀释的β-actin一抗（鼠的单克隆抗体）4℃ 孵育过夜，次日用Wash Buffer洗涤3次，每次5 min，用抗兔和抗鼠的荧光二抗（1∶100）室温避光孵育2 h后，洗涤3次（避光）用odyssey扫描NC膜。

1.6 数据统计

试验数据用SPSS 16.0软件进行分析，结果以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验及单因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 p EF1α-HO-23AcGFP真核表达载体的鉴定

HO-2 cDNA PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示PCR扩增的目的条带为均一条带，条带848 bp大小（见图1）。经EcoR I酶、Bam H I酶对重组载体进行双酶切后琼脂糖凝胶电泳结果，显示得到两个条带，大小符合预期结果（见图2），表明重组载体构建成功。

2.2 重组载体转染小鼠脑血管内皮细胞后HO-2在mRNA水平表达

重组载体和空载体转染48 h后，实时定量结果显示（图3）：重组载体转染的小鼠脑血管内皮细胞过表达HO-2基因m RNA水平极显著高于对照组（P＜0.01），说明重组载体在小鼠脑血管内皮细胞中能够过表达。

2.3 重组载体转染小鼠脑血管内皮细胞后HO-2在蛋白水平表达

重组载体和空载体转染小鼠脑血管内皮细胞，48 h后提取总蛋白，Western blot方法检测结果（图4）显示：重组载体（HO-2 overexp）和空载体（Control）转染的细胞蛋白在36 k D处有特异性条带，重组载体组较空载体组条带明显（A）。统计学分析：重组载体转染的小鼠脑血管内皮细胞HO-2基因蛋白水平显著高于对照组，P＜0.05（B）。

图1 HO-2 cDNA琼脂糖凝胶电泳结果M.marker 3；1.HO-2 cDNAFig.1 The result of agarose gel electfophoresisof HO-2 cDNA（M.marker 3；1.HO-2

图2 重组载体EcoR I／Bam H I双酶切琼脂糖凝胶电泳结果M.marker3，1.重组载体的双酶切片段Fig.2 The result of agarose gel electfophoresis of recombinant vector by EcoR I／Bam H I double enzyme digestionM.marker3，1.double enzyme segment of recombinant vector

3 讨 论

图3 实时定量PCR检测重组载体转染后HO-2基因m RNA的表达水平与空载体相比，＃P＜0.01Fig.3 Statistical graph of detection of HO-2 gene mRNA expression after recombinant vector transfection by Real-time PCR＃P＜0.01 vs empty vector

HO-2主要分布于中枢神经系统、血管内皮中，在体内持续表达，分子量约为36 k D，它能对抗氧化应激和细胞凋亡，参与急性炎症反应修复，减少炎症损伤。HO-2抗凋亡抗炎症反应的作用机制，目前多认为与它降解血红素产生的CO神经信使的作用有关［7］。有研究表明HO-2在TNF-α引起的大脑血管内皮细胞氧化应激和细胞凋亡中有保护作用，HO-2表达量增加能明显减弱TNF-α引起的损伤［8-9］。然而HO-2与TNF-α之间的作用机制尚不清楚。TLR4介导的信号转导途径可分为My D88依赖和MyD88非依赖途径［10］。当TLR4受到脂多糖等效应物刺激后能通过My D88依赖的信号通路上调TNF-a的表达量。HO-2基因敲除鼠与野生型鼠比较发现，HO-2基因敲除鼠中炎症分子水平的明显升高，其中包括 TNF-α［11-12］。据此可推测HO-2可能通过TLR4的My D88依赖的信号通路抑制TNF-a的表达。为此，我们构建了它的真核表达载体，检测HO-2基因过表达后能否通过MyD88依赖的TLR4信号通路减少抑制TNF-a的表达。

图4 Western blot检测重组载体转染后HO-2在蛋白水平表达情况A.Western blot图，B.统计学分析图。与control相比，＊P＜0.05。Fig.4 Detection of HO-2 expression in protein levels after recombinant vector transfection by Western blotA.Picture of Western blot，B.Statistical graph.＊P＜0.05 vs control.

本试验重组得到HO-2的真核表达载体p EF1α-HO-2-AcGFP，双酶切鉴定和测序表明载体构建成功。定量PCR和Western blot显示pEF1α-HO-2-AcGFP能在小鼠脑血管内皮细胞成功过表达，且达显著水平。为下一步研究HO-2基因抗凋亡、抗氧化、减少炎症损伤机制奠定了基础。

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