应用RNAi技术提高畜禽抗病及生产性状的研究进展

赵春萍，曹 婷，施力光，张立岭，侯冠彧＊

（1.中国热带农业科学院 热带作物品种资源研究所，海南 儋州571737；2.海南大学 农学院，海南 海口570228）

RNA 干扰（RNA interterence，RNAi）具有高度保守的特点，普遍存在于动植物体内，是由双链RNA引起的特异性沉默靶基因的免疫应答反应。RNAi技术能特异性抑制生物体内源功能基因的表达，进而通过表型或生理生化指标的变化来反映该基因的功能。随着基因组测序工作的完成，我们也逐渐进入了后基因组时代，基因的功能分析已成为现在的科研重点。自发现RNA干扰现象普遍存在线虫、果蝇、小鼠和植物等生物体内以来，RNAi已发展成为一种简便、快速、高效的分析基因组功能的有力工具，也为由基因到功能的反向遗传学途径提供了功能研究的桥梁。

在哺乳动物中，研究基因组功能最为常用的方法是通过同源重组进行基因打靶（Gene target）达到基因敲除（Knock out）的目的，但是这种方法往往会造成细胞凋亡，而且也不适用于未建立胚胎干细胞的动物。同时，基因打靶也存在操作难、周期长等缺点。在线虫、果蝇和植物中，RNAi成功应用的长双链RNA（＞29 bp）又不可避免干扰素效应导致的全面关闭蛋白合成的后果［1］。2001年，Caplen等［2］和Elbashir等［3］发现短至21～22 nt的小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）能够在哺乳动物细胞中诱导有效的RNAi，而不诱发干扰素反应。这一研究的发现全面开启了RNAi技术在哺乳动物中应用的新篇章。本文主要针对近几年RNAi在畜禽方面的研究进展做出总结与展望。

1 RNAi机制

随着RNAi生化和遗传学知识、数据的积累，科学家们已证实RNAi是由dsRNA诱导的多步骤、多因素参与的过程，但其真正的机理暂时还不清楚。目前认为一般分为以下几个步骤：

起始阶段：dsRNA进入细胞→由Dicer核酸酶特异性识别→借助ATP功能的形式切割dsRNA→得到21～23 nt（或bp）的同源小片段siRNA，siRNA与mRNA→识别目标mRNA→启动RNAi反应。

效应阶段：siRNA与核酸酶等蛋白质结合→形成RNA→诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）→依靠ATP提供能量解开siRNA双链→激活RISC→活化后的RISC定位到于siRNA中的反义链互补的靶mRNA转录本上→在距离siRNA 3′端12个碱基的位置切割m RNA→降解靶 mRNA［4］。

放大阶段：被降解的mRNA片段，在RNA聚合酶的作用下，形成小双链RNA加入到RNAi的起始阶段，从而起到了放大的作用。此过程如图1所示。

图1 RNAi作用机理示意图Fig.1 RNAi mechanism schematic diagram

RNAi的小非编码片段主要有三种：piRNAs（PIWI-interacting RNAs）miRNAs（microRNAs），和siRNAs（small interfering RNA）［5］。其中 piRNAs和miRNAs属内源性，由机体内基因组转录加工形成的非编码RNA小片段。而siRNAs一直被认为是专门处理外源致病RNA（比如病毒）的片段，但随着在动物细胞内大量内源性siRNAs表达的发现使这一观点有所改变［6-7］。目前在哺乳动物体内已知有数以千计的piRNAs由成簇的重复序列编码产生，同时还有超过1000种的miRNAs，这些数据并不完善，还需要进一步地发现确定。在RNAi的起始阶段，RNAi前体要经过一系列酶切过程才能形成有效的RNA片段，进而与蛋白质结合形成RISC。参与miRNAs加工的酶主要有RNAse III蛋白Drosha和Dicer，siRNAs仅依靠Dicer，而加工piRNAs的核酸酶现在还不确定［8］。miRNA-RISC和siRNA-RISC的主要蛋白是AGO（Argonaute proteins）蛋白，piRNA-RISC的是PIWI蛋白。在沉默复合体中，RNAi的指导链与靶m RNA链存在着完全和不完全配对两种形式，miRNA为不完全配对，其他两种则执行完全配对原则。miRNA的这种配对方式也导致其具有更广泛的沉默范围。

2 RNAi在畜禽传染性疾病方面的应用

畜牧业是人类重要食物、经济来源的支柱产业之一，然而病毒性疾病以其发病快，影响大等特点严重影响其稳步快速的发展，有些病毒不仅能在畜禽中传播，甚至可以在人类中发病，严重的能导致死亡。面对这些病毒，科研人员往往利用抗体来治疗。但是抗体具有高度特异性，只能针对某种抗原。而病毒在传播过程中，通常会对这些药物产生耐药性，即通过本身的基因变异来躲避抗体。病毒的变异速度远远高于抗体的制备速度，而病毒在宿主体增殖过程中，都要经过m RNA过程来翻译蛋白质，这样便能利用RNAi技术来预防和控制病毒的传播。

2.1 在猪瘟中的应用

猪瘟病以其高发病率和高死亡率的特点，严重危害了养猪业的发展，并被世界动物卫生组织（OIE）列为必须上报的动物传染病之一，同时我国也将其列为一类动物传染病。目前，在对抗猪瘟主要应用兔化弱毒疫苗，但其效果越来越不理想。Li等［9］以猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）的NS3、Npro、NS5B为靶基因分别设计siRNA序列，构建使用相同或四个不同启动子的单、双和四siRNA表达质粒，与NS3、Npro、NS5B表达质粒共转染PK-15细胞，通过RT-PCR和荧光蛋白的表达检测siRNA的抑制效果。结果表明，单个或多个siRNA表达质粒都可以有效地抑制CSFV复制，然而针对不同基因表达的多个siRNAs质粒载体明显具有更强的抑制效果。这一研究为更有效的治疗猪瘟提供了一定的理论基础。宋红芹等［10］针对非洲猪瘟 病 毒 （African swine fever virus，ASFV）NP419L基因设计的5对shRNA干扰序列也得到了良好的抑制效果，其中两对干扰效率达到87%以上，其他三对存在显著性差异（P＜0.05）。为进一步体内实验奠定了基础。

目前的研究表明，siRNA作为一种抑制CSFV的有效制剂，虽然不能完全抑制病毒在宿主体内的复制，但也可以降低其增殖速度，为激活自身机体免疫效应争取时间，同时也为新型抗CSFV药物的研制提供了参考。

2.2 在口蹄疫中的应用

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）因为传播迅速、发病率高的特点严重影响了偶蹄动物的养殖，该病广泛流行于世界各国，已被OIE列为A类家畜传染病之首，我国农业部也将其列为第一类动物疫病的第一病。Ke等［11］以口蹄疫病毒（Footand-mouth disease virus，FMDV）VP1基因为靶目标，设计并筛选出了5条效率较高的特异性siRNA片段。用这5条siRNA片段分别与报告基因共转染BHK-21细胞，结果发现siRNA只能短暂性抑制FMDV的复制，48小时后都出现了CPE现象，提取RNA测序分析，发现VP1出现了单核苷酸转换，从而增强了RNAi抗性。Cong等［12］针对FMDV高度保守的3D，VP4和2B基因序列设计siRNA，构建siRNA表达质粒载体，与FMVD共转染BHK-21细胞，发现siRNA有较高的抑制效果，将siRNA表达质粒注入到已感染的乳鼠中，结果延迟了乳鼠的死亡。随后以弱毒的S.choleraesuis为siRNA表达质粒的载体，与FMDV分别感染guinea pigs和swine都起到了良好的保护效果。研究显示，弱毒的S.choleraesuis因其成本低且对猪具有安全性的特点从而可以作为RNAi的递呈系统大规模生产。目前没有一种疫苗或药剂可以完全、快速、有效的抑制FMD。所以Kim等［13］结合抗病毒药剂和siRNA共同抑制FMD。结果表明，重组腺病毒siRNA表达载体与ribavirin混合使用可以明显增强对FMDV的抑制效果，其效率高于单独使用其中的任意一种。

口蹄疫病毒可分为7个血清型，且型间没有交叉保护作用，用疫苗治疗口蹄疫并不能得到很好的疗效。近年来的研究表明，RNAi技术作为一种新的基因治疗手段，可以有效的抑制病毒，而且当与抗病毒药剂结合使用时，可以起到更好的效果。

2.3 在朊病毒中的应用

朊病毒是由内源性朊蛋白基因（prion protein gene，prnp）编码的朊蛋白（prion protein，PrP），正常细胞都会转录翻译该蛋白质。该病毒可导致海绵状脑病，主要包括疯牛病、一些羊病、鹿病、人的克雅氏症（Creuzfeldt-Jacob disease，CJD）、吉斯特曼-斯召斯列综合症（Gerstmann-Straussler syndrome，GSS）、库鲁症（Kuru）等。Mallucci等［14］研究表明敲除PrPc的转基因小鼠可以抵抗朊蛋白病，并且Pr P产量减少一半的动物可以抵抗疯牛病。由于Pr P的功能尚不完全清楚，敲除该基因可能会有副作用，而RNAi途径正好可以避免这问题的发生。Li等［15］构建了山羊prnp基因和针对该基因的siRNA质粒表达载体，两者共转染293T细胞后经RTPCR检测prnp的表达量，发现该质粒载体可以有效的介导和表达siRNA，并达到抑制的效果。而Michael等［16］利用慢病毒介导的sh RNA表达载体感染山羊成纤维细胞，构建稳定表达的细胞系，又以此细胞为核供体细胞，进行体细胞和移植获得转基因胎儿，利用RT-PCR和 Western blot检测发现，胎儿的所有组织的prnp基因表达都被敲低。随后以同样的方法应用在牛科动物上得到了同样的效果。该方法可以应用到家畜朊病毒的预防。

目前RNAi技术已经应用到畜禽传染性疾病的各个方面，其主要方向是针对某种病的致病病毒的必须蛋白的基因的高度保守序列设计sh RNA片段，并构建表达载体，利用慢病毒或腺病毒介导，将sh RNA整合到动物基因组中，最后应用体细胞核移植技术获得具有抗病基因的转基因动物。

2.4 在新城疫病毒中的应用

新城疫（Newcastle disease，ND）是造成禽类养殖业经济损失的主要病症之一，该病由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引发，NDV 是单链的负链RNA病毒，基因组总长度大约为15Kb，又称一型禽副粘病毒（avian paramyxovirus type 1，AMPV-1）。主要编码六种蛋白质：核蛋白（NP），磷蛋白或 V蛋白（P／V），基质蛋白（M），融合糖蛋白（F），haemagglutinin neuraminidase glycoprotein（HN），大聚合酶蛋白（L），其顺序为＇3-NP-P-M-FHN-L-5＇。根据NDV对鸟类致病性程度可将其分为强毒型、中毒型和弱毒型三种。M蛋白是NDV编码六个蛋白中最小的一个，其主要是构成病毒核蛋白的内部囊膜。Yin等［17］针对M基因的641和827位点设计了sh RNA，分别命名为pSM641和pSM827，并得到了较好的抑制效果，其中pSM641的抑制效率高达94.6%，并显著的降低了CPE的出现。这一结果表明RNAi针对M基因不仅可以作为有效的抗病治疗方法也可以作为研究DNV复制的辅助方法。YUE等［18］针对NP基因设计的sh RNA同样也得到了良好的抑制的效果，其中最高的抑制效率高达94.14%。

迄今为止，越来越多的研究表明RNAi作为动植物抗病毒药物制剂具有良好的效果和广阔的前景，但是其中大部分为体外研究，而体内研究很少。让RNAi完全的发挥其治疗的作用的关键是怎么高效地将RNAi片段递呈到靶细胞。递呈RNA片段的过程中主要存在两个问题。首先是生理学方面的障碍，如siRNA要经过血液到达靶器官，在经过血管到细胞间质，接着越过细胞膜到达细胞质中，最后通过核膜到达细胞核中。第二个就是外源RNA片段本身的稳定性问题，如在人血液中siRNA和裸露质粒的半衰期只有几分钟［19-20］。目前主要从生物、化学和物理三面来解决这些问题。生物学方法主要是利用病毒载体，如慢病毒、腺病毒、反转录病毒和疱疹病毒载体。病毒载体在体内或体外实验都具有高效的沉默效率［21-23］，但是仍存在着具有免疫原性，毒性和引起宿主细胞基因组插入突变，不能大量表达病毒载体等缺陷［24-25］。化学方法主要是阳离子复合物包被RNAi片段，这种方法主要是应用与体外细胞实验，而该方法最大的问题是具有一定的细胞毒性［26］。物理方法是直接干扰细胞质膜让RNAi和质粒通过。目前主要是通过流体力学，射击法，渗透法，超声波和电场微调法来实现递呈，这些方法目前还是应用与体外研究，也许有希望应用与体内研究。作为抗病毒药剂要不仅要有良好的治疗效果，而且还要对机体没有伤害，生物学方法虽然有较好的效果，但是对机体健康还是有一定风险的，物理和化学方法还不能应用与体内，由此可见，RNAi作为一种抗病毒药剂还需要很长的一段路程。

3 RNAi在改善畜禽生产性状的应用

随着社会经济与科技的飞速发展和生活水平的不断提高，人们对畜产品的品质要求和需求量愈发增加。提高猪、牛、羊的产肉性能和畜产品的品质现已成为科学研究者、养殖户以及消费者最为关心的问题。

双肌牛因其特有的饲料报酬高、瘦肉率高、生长快的优点引起了学者们的广泛关注，迄今为止，在牛、羊、猪、鼠中均发现有双肌性状的表型，甚至在人中也有这种表型的出现。Mepherron等［27］在小鼠骨骼肌cDNA文库中扩增出一段新的序列，经实验证明该序列是转化生长因子（TGF-β）超家族中的成员，是肌肉生长的负调控因子。命名为肌肉生长抑制素（MSTN），又称为生长分化因子8（GDF-8）。研究表明，该基因的缺失或突变就会导致肌肉过度生长或肥大，即双肌现象。目前科研人员主要应用RNAi技术，特异性敲低MSTN的表达，从而得到具有双肌性状的动物。Jain等［28］设计4条sh RNA序列，并构建了质粒表达载体，转染到羊成纤维细胞系中，筛选出两条高效抑制MSTN的序列，抑制效率分别为80.5%和92.4%。Ajai等［29］应用同样的方法在鸡的胚胎成纤维细胞中也筛选出了具有高效抑制效率的shRNA序列。说明RNAi技术可以应用于动物双肌性状的产生。Liu等［30］利用RNAi技术干扰表达羊MSTN的同时，伴随着MyoD和myogenin的上调，以及Smad3的下调，该作用机制与小鼠类似。Hu等［31］构建sh RNA表达载体，随后利用体细胞核移植技术得到5只小羊，其中有3只发现了shRNA的表达，抑制了MSTN的表达，其生长性状明显高于其他2只。由此可见，我们可以应用RNAi技术构建MSTN干扰表达的转基因家畜，从而提到高其产肉性能。

作为营养来源的奶制品是人们尤其是婴儿的必须品之一，但由于β乳球蛋白（β-lactoglobulin，BLG）作为一种主要的抗敏原的存在（占牛乳清蛋白总量的56%-60%）使部分人群不能利用乳产品。为了去除抗敏原，科研人员采用很多方法（如热处理、酶解、发酵、糖基化和 Maillard反应等）并没起到良好作用［32-34］。Zhang等［35］曾构建 BLG 过表达载体，转染到山羊胚胎成纤维细胞中，同时用慢病毒介导的shRNA表达载体感染该细胞，使shRNA表达体系稳定的整合到山羊基因组中，由此获得了在胚胎成纤维细胞中稳定表达的细胞系。这为干扰表达BLG的转基因羊的生成提供了理论依据。

RNAi技术应用于改善畜禽的生产性状主要是利用siRNA敲低某个对生产性状不利的基因，并将该siRNA的表达体系整合到宿主基因组中，再通过体细胞核移植技术构建重构胚，以期得到可以稳定表达的转基因个体。但是转基因动物的构建仍然是生物学的难点，而且其成本依然很高。这些都严重影响着RNAi技术在这方面的应用。Matoba等［36］利用RNAi敲低了小鼠重构胚中Xist基因（负责X染色体失活的基因），使重构胚的存活率比对照组高十倍。结果表明利用体细胞核移植构建转基因动物的方法还是有希望应用于生产实践中的。

4 问题与展望

自RNAi现象被发现以来，其一直成为生命科学领域的研究热点，并以其显著的优势迅速发展成一项研究反向遗传学强有力的工具。但就目前的研究来看，RNAi的作用机制尚不完全清楚，同时对基因功能的复杂性认识仍然很匮乏。即使利用慢病毒介导将siRNA整合的宿主基因组中，并得到稳定表达，但是对生物的整个生命过程是否有影响，我们仍然不清楚。应用RNAi技术还存在一些安全性问题，由于siRNA片段可以降解与其同源的RNA，在对动物疾病的治疗过程中，siRNA也有可能将宿主内源RNA同时降解，对动物造成不同程度的损伤甚至死亡。Grimm等［37］将大剂量的sh RNA注入到小鼠体内时，使部分小鼠细胞内的正常RNA功能受到干扰，严重者甚至死亡。这表明我们在应用RNAi技术进行基因治疗时一定要更加谨慎。有研究报道，RNAi也可以引起自身的防御机制，如干扰素反应，这一防御反应也会造成机体自身的损害。RNAi技术在对疾病治疗的应用方面取得了不少成果，但这其中还是存在着一些问题，用RNAi进行疾病治疗时其效果无法保证，即使应用软件设计得分很高的siRNA片段，其抑制效果仍然有可能很低。在对病毒性疾病治疗的过程中，往往会出现病毒逃逸的突变体，导致RNAi无法识别。因此RNAi的应用仍然存在着很多问题，如RNAi抑制效果的时效性，启动子、载体的选择等都有待解决。

RNAi虽然还存在着诸多问题，但还是为人们研究基因功能提供了新的方法和思路。RNAi的出现同时也给HIV、脊髓灰质炎、丙肝和肿瘤等疾病的治疗带来希望。随着RNAi分子机制的进一步揭示及其技术实现策略的不段改进，RNAi将很快应用到更多的大型动物模型上，而且RNAi的高通量应用也将实现，这势必会更好地造福于人类。

［1］ 唐中伟，冯亦平.RNAi在哺乳动物中的研究新进展［J］.农业与技术，2010，30（4）：67-72.

［2］ Caplen N J，Parrish S，Imani F，et al.Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2001，98（17）：9 742-9 747.

［3］ Elbashir S M，Lendeckel W，Tuschl T.RNA interference is mediated by 21-and 22-nucleotide RNAs［J］.Genes ＆ Development，2001，15（2）：188-200.

［4］ 陈贵元，谭德勇.RNA干扰的研究现状与应用前景［J］.大理学院学报，2012，11（10）：52-55.

［5］ Kuan-Teh Jeang.RNAi in the regulation of mammalian viral infections［J］.Jeang BMC Biology，2012，10：58.

［6］ Okamura K，Lai EC：Endogenous small interfering RNAs in animals［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9：673-678.

［7］ Golden D E，Gerbasi VR，Sontheimer E J.An inside job for siRNAs［J］.Mol Cell，2008，31：309-312.

［8］ Rother S，Meister G.Small RNAs derived from longer non-coding RNAs［J］.Biochimie，2011，93：1 905-1 915.

［9］ Jiangnan Li，Yajuan Dai，et al.In vitro inhibition of CSFV replication by multiple siRNA expression［J］.Antiviral Research，2011，91：209-216.

［10］ 宋红芹，姜翠翠，张鑫宇等.非洲猪瘟病毒NP419L基因shRNA表达质粒的构建与筛选［J］.中国兽医科学，2013，43（1）：9-14.

［11］ Ke Lv，Yingjun Guo，Yiliang Zhang，et al.Transient inhibition of foot-and-mouth disease virus replication by siRNAs silen-cing VP1 protein coding region［J］.Veterinary Science，2009，86：443-452.

［12］ Wei Cong，Hong Jin，Cheng Dajiang，et al.Attenuated Salmonella choleraesuis-mediated RNAi targeted to conserved regions against foot-and-mouth disease virus in guinea pigs and swine［J］.Veterinary Research，2010，41（3）：30-46.

［13］ Kim Su-Mi，Jong-Hyeon Park，Kwang-Nyeong Lee，et al.Enhanced inhibition of foot-and-mouth disease virus by combinations of porcine interferon-aand antiviral agents［J］.Antiviral Research，2012，96：213-220.

［14］ Mallucci G，Dickinson A，Linehan J，et al.Depleting neuronal PrP in prion infection prevents disease and reverses spongiosis［J］.Science，2003，302（5646）：871-874.

［15］ Yongjun Li，Wenting Li，Taikun Li，et al.Construction of RNAi Expressing Vector Targeting the Goat Prion Protein（PRNP）［J］.Animal and Veterinary Advances，2012，11（8）：1 208-1 212.

［16］ Michael C.Golding，Charles R.Long，Michelle A.Carmell，et al.Suppression of prion protein in livestock by RNA interference［J］.PNAS，2006，103（14）：5 285-5 290.

［17］ Renfu Yin，Zhuang Ding，Xinxin Liu，et al.Inhibition of Newcastle disease virus replication by RNA interference targeting the matrix protein gene in chicken embryo fibroblasts［J］.Journal of Virological Methods，2010，167：107-111.

［18］ Hua YUE，Dingfei Li，Anjing Fu，et al.shRNA-triggered RNAi inhibits expression of NDV NP gene in chicken embryo fibroblast［J］.Front.Biol.China，2008，3（4）：433-438.

［19］ Fougerolles A，Vornlocher H.P，Maraganore J，et al.Interfering with disease：a progress report on siRNA-based therapeutics［J］.Nat.Rev.Drug Discov，2007，6：443-453.

［20］ Henshaw J W，Yuan F.Field distribution and DNA transport in solid tumors during electric field-mediated gene delivery［J］.Pharm Sci，2008，97：691-711.

［21］ Ehlert E M，Eggers R，Niclou S P，et al.Cellular toxicity following application of adeno-associated viral vector-mediated RNA interference in the nervous system［J］.BMC Neurosci，2010，11：20.

［22］ Chen M，Payne W S，Dunn J R，et al.Retroviral delivery of RNA interference against Marek＇s disease virus in vivo［J］.Poult Sci，2009，88：1 373-1 380.

［23］ Stephanie Rivera，Fan Yuan.Critical Issues in Delivery of RNAi Therapeutics In Vivo［J］.Current Pharmaceutical Biotechnology，2012，13：1 279-1 291.

［24］ Howard B A，Furumai R，Campa M J，et al.Stable RNA interferencemediated suppression of cyclophilin A diminishes nonsmall-cell lung tumor growth in vivo［J］.Cancer Res，2005，65：8 853-8 860.

［25］ Chen W，Liu M，Jiao Y，et al.Adenovirus-mediated RNA interference against foot-and-mouth disease virus infection both in vitro and in vivo［J］.Virol，2006，80：3 559-3 566.

［26］ Tönges L，Lingor P，Egle R，et al.Stearylated octaarginine and artificial virus-like particles for transfection of siRNA into primary rat neurons［J］.RNA，2006，12：1 431-1 438.

［27］ Mepherron A C.Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-BsuPerfamily member［J］.Nuture，1997，387：83-90.

［28］ Hemlata Jain，Sanjeev Singh，Megha Kadam，et al.Knockdown of the myostatin gene by RNA interference in caprine fibroblast cells［J］.Journal of Biotechnology，2010，145：99-102.

［29］ Ajai K Tripathi，Mansi K Aparnathi，Sagar S Vyavahare，et al.Myostatin gene silencing by RNA interference in chicken embryo fibroblast cells［J］.Journal of Biotechnology，2012，160：140-145.

［30］ Chenxi Liu，Wenrong Li，Xuemei Zhang，et al.The critical role of myostatin in differentiation of sheep myoblasts［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2012，422：381-386.

［31］ Shengwei Hu，Wei Ni，Wujiafu Sai，et al.Knockdown of Myostatin Expression by RNAi Enhances Muscle Growth in Transgenic Sheep［J］.PLoS ONE，2013，8（3）：e58521.

［32］ Hattori M，Miyakawa S，Ohama Y，et al.Reduced immunoge-nicity of b-lactoglobulin by conjugation with acidic oligosaccharides［J］.Agr Food Chem，2004，52：4 546-4 553.

［33］ Ehn B M，Allmere T，Telemo E，et al.Modification of IgE binding to b-lactoglobulin by fermentation and proteolysis of cow＇s milk［J］.Agr Food Chem，2005，53：3 743-3 748.

［34］ Bu G，Luo Y，Lu J，et al.Reduced antigenicity of b-lactoglobulin by conjugation with glucose through controlled Maillard reaction conditions［J］.Food Agr Immunol，2010，21：143-156.

［35］ Shumin Zhang，Kai Xiong，Zhourui Xie，et al.Stable silencing of-lactoglobulin（BLG）gene by lentivirus-mediated RNAi in goat fetal fibroblasts［J］.Genetics and Molecular Biology，2012，35（3）：680-685.

［36］ Shogo Matoba，Kimiko Inoue，Takashi Kohda，et al.RNAimediated knockdown of Xist can rescue the impaired postimplantation development of cloned mouse embryos［J］.PNAS，2011，108（51）：20 621-20 626.

［37］ Grimm D，Streetz K L，Jopling C L，et al.Farality in mice due to oversaturation of cellular microRNA／short hairpin RNA pathways［J］.Nature，2006，44l（7092）：537-541.