生防菌株MT-06发酵条件及复配杀菌剂对小麦赤霉病的防效

毛雪琴，彭志荣，邱海萍，张 震，王艳丽，柴荣耀，姜 华，王教瑜，杜新法，孙国昌

(1.浙江省植物有害生物防控重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，浙江杭州 310021;2.杂交水稻国家重点实验室湖南杂交水稻研究中心，湖南长沙 410125)

小麦赤霉病是禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的麦类常见的真菌性病害，发生广泛，在我国流行很广，特别是在雨量充足的长江中下游地区，造成麦类减产，品质下降，经济损失严重［1-2］。1992-2001年，小麦赤霉病所造成的损失占总的麦类病害损失的35.7%［3］，此外还产生毒素，对人体健康及家禽家畜产生毒害［4］。

现阶段对于赤霉病的防治主要依赖化学农药，长期使用造成农药残留对人体的毒害，使植物产生抗药性而防效降低，故开发生产选择性强、环境兼容性好、不易产生抗药性的生物农药势在必行。目前用于防治赤霉病的生防制剂主要是芽孢杆菌(Bacillus spp.)和假单胞杆菌(Pseudomonas spp．)［5-7］等细菌类产品。生防真菌能够重寄生于病原菌并能够长期定殖于防治对象而使效果持续时间延长［8］。现阶段能够防治赤霉病的真菌性生物制剂很少，对赤霉病有效的真菌性生防菌株也鲜见报道。

MT-06是本试验室从草莓炭疽病标样上分离获得的黄蓝状菌 (Talaromyces flavus)，前期试验结果表明，该菌株对大麦赤霉病菌等多种病原真菌具有较好的抑制作用［9］。本试验分析了MT-06发酵液的最适培养条件及其对禾谷镰刀菌菌丝和分生孢子的抑制作用，探讨了抑菌活性物质的萃取方法及粗提物的抑菌活性，并进行了MT-06与化学杀菌剂甲霜锰锌混配防治小麦赤霉病的田间小区试验，为生防菌MT-06的开发利用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 供试菌株及药剂

黄蓝状菌MT-06及禾谷镰刀菌FG-10均为本实验室分离鉴定保存;化学杀菌剂甲霜锰锌可湿性粉剂 (代森锰锌64%，甲霜灵8%)由利民化工有限公司生产;化学药剂石油醚、乙酸乙酯和正丁醇均由杭州双林化工生产。

1.2 发酵液对禾谷镰刀菌的抑制作用

1.2.1 发酵液的制备

将MT-06活化至PDA平板上，培养7 d后，打取5块直径为7 mm的菌饼，置于PDB(马铃薯葡萄糖液体培养基)培养基上，于28℃、150 r·min-1培养3 d。取孢子浓度1×106个·mL-1的发酵液，按5%接种量接种于装有300 mL灭菌PDB的1 L三角瓶中，置于28℃、150 r·min-1摇床培养，12 d后，将培养液用滤纸滤去菌丝后，4℃下12 000 r·min-1离心30 min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后4℃避光冷藏备用。

1.2.2 发酵液对禾谷镰刀菌丝生长及产孢的影响

平板抑制试验。将灭菌后的PDA自然冷却至60℃左右，在9 cm平板中加入18 mL PDA+2 mL发酵液，对照组为18 mL PDA+2 mL无菌水，待平板凝固后，用打孔器打取7 mm活化培养3 d后的禾谷镰刀菌菌饼，置于平板中央，28℃避光培养4 d，十字交叉量取记录菌落直径，并取平均值。每处理重复3次，试验重复2次。

抑菌率/%=(对照平均直径-处理平均直径)/(对照平均直径-菌块直径) ×100。

凹玻片抑制试验。挑取少量PDA培养基上活化培养3 d后的禾谷镰刀菌菌丝于分别装有200 μL无菌水和MT-06发酵液的凹玻片中，28℃避光保湿培养48 h。目测菌丝生长情况，于显微镜100倍下观察拍照。每处理重复3次，试验重复2次。

1.2.3 发酵液对禾谷镰刀菌分生孢子萌发的影响

平板抑制试验。禾谷镰刀菌孢子悬液通过0.45 μm孔径滤膜除去菌丝，调整孢子浓度为1×106个·mL-1备用。将 100 μL 孢子液 +100 μL MT-06发酵液加入PDA平板上的牛津杯中，加入100 μL孢子液+100 μL无菌水为对照，28℃避光培养48 h，观察孢子萌发情况。每处理重复3次，试验重复2次。

凹玻片抑制试验。在试验组中加入100 μL禾谷镰刀菌分生孢子液+100 μL MT-06发酵液，对照组中加入100 μL禾谷镰刀菌分生孢子液 +100 μL无菌水，28℃避光培养48 h，观察孢子萌发情况。每处理重复3次，试验重复2次。

1.3 发酵液最佳培养时间测定

发酵液制备同1.2.1节。每24 h收集1次，连续收集30 d。以禾谷镰刀菌为靶标菌，进行不同培养时间发酵液抑菌活性测定，方法同1.2.2节。每处理重复3次，试验重复2次。

1.4 发酵液萃取方法及活性物质抑菌测定

将MT-06发酵液分别用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇等体积萃取3次，合并有机相，旋转蒸干，得粗提物;按500 μg·mL-1的浓度用萃取剂溶解粗提物，以禾谷镰刀菌为靶标，设置粗提物浓度分别为20，40，60，80，100 μg·mL-1，以 100 μg·mL-1百菌清为阳性对照，进行抑菌活性测定，方法同1.2.2节。

1.5 田间小区试验

1.5.1 试验地点及品种

在浙江省宁海县越溪乡灰场村进行，供试小麦品种为扬麦12号，播种方式为撒播。小麦赤霉病为田间自然发病，其他按常规栽培管理。

1.5.2 试验设计

本试验共设7个处理:①4 mg·mL-1甲霜锰锌;②1×106个·mL-1MT-06孢子液+2 mg·mL-1甲霜锰锌;③1×106个·mL-1MT-06孢子液;④MT-06发酵液;⑤稀释5倍的 MT-06发酵液;⑥稀释10倍的MT-06发酵液;⑦清水对照。每处理设3小区，每小区40 m2，随机区组排列。其中MT-06孢子液的制备方法为MT-06孢子悬液通过0.45 μm孔径滤膜除去菌丝，调整孢子浓度为1×106个·mL-1后备用。待小麦完全抽穗后按750 kg·hm-2喷雾量使用山东卫士WS-16P喷雾器进行均匀喷洒。20 d后进行病情调查，调查方法、病情指数及防治效果计算参照GB/T 15796—1995。

1.6 数据分析

所有数据分析参见唐启义等编著的第2版DPS软件［10］，通过Duncan’s新复极差法进行比较。

2 结果与分析

2.1 发酵液对禾谷镰刀菌菌丝生长的抑制作用

平板抑制试验结果如图1中A所示。培养4 d的结果显示，稀释10倍后的MT-06发酵液对禾谷镰刀菌丝生长抑制率为40.1%，表明MT-06发酵液对禾谷镰刀菌具有较强的抑制作用。凹玻片抑制试验目测观察如图1中B所示。

置于MT-06发酵液和无菌水凹玻片中的禾谷镰刀菌丝于28℃下保湿培养48 h后，对照组中禾谷镰刀菌丝团增大变红，试验组基本无变化。镜检显示，对照组产生了大量分生孢子 (图1中C)，而试验组则基本没有产生分生孢子 (图1中D)。表明发酵液对禾谷镰刀菌丝产孢具有强烈的抑制作用。

2.2 发酵液对镰刀菌分生孢子萌发的影响

平板抑制试验表明，与等量MT-06发酵液混合后，禾谷镰刀菌分生孢子不能萌发，抑制率达100%(图2中B)。凹玻片抑制试验镜检显示，与等量MT-06发酵液混合的禾谷镰刀菌分生孢子胞壁和隔膜变厚，两头变钝，不能正常萌发 (图2中D)，与水混合的禾谷镰刀菌分生孢子能正常萌发伸长产生菌丝 (图2中E)。表明MT-06对禾谷镰刀菌分生孢子的萌发具有强烈的抑制作用。

图2 发酵液对镰刀菌分生孢子萌发的影响

2.3 发酵液的最佳培养时间

通过30 d的取样，将不同培养时间的MT-06发酵液稀释10倍后，对禾谷镰刀菌的抑菌活性测定结果表明，在PDB培养基中，28℃、150 r·min-1条件下，培养初期随着时间的增加，MT-06发酵液抑菌活性越来越强，在第14天达到高峰，平板抑菌效果达到最高，为42.2%。随着培养时间继续增加，发酵液抑菌活性逐渐降低，第30天下降为18.7%。表明有效抑菌物质在后期产量下降较快，并有一定降解，但仍具有部分抑菌活性，其中可能有部分抑菌活性物质的化学性质较稳定。综上可知，在既定条件下，MT-06的最佳发酵时间为14 d(图3)。

2.4 萃取方法及活性物质抑菌测定

图3 发酵液在不同培养时间对镰刀菌丝生长的抑制

通过不同萃取剂萃取后的抑菌测定发现，正丁醇和石油醚萃取物抑菌效果不明显，而乙酸乙酯萃取物抑菌活性较强。稀释10倍后抑菌率达到44.91%，由此确定萃取剂为乙酸乙酯 (图4)。

图4 乙酸乙酯萃取液对小麦赤霉病菌丝生长的影响

随后通过乙酸乙酯大量萃取MT-06发酵液，进行活性粗提物抑菌测定 (表1)。

表1 乙酸乙酯粗提物对小麦赤霉病菌的抑制作用

以禾谷镰刀菌为靶标，设置粗提物浓度分别为20，40，60，80，100 μg·mL-1，对照组为 100 μg·mL-1的百菌清。结果表明，随着萃取物浓度提高，抑菌效果增强;当萃取物浓度为80 μg·mL-1时，抑菌活性与百菌清相当;当浓度提高到100 μg·mL-1时，抑菌效果显著高于百菌清，达到71.80%。

2.5 田间小区试验

田间试验结果 (表2)表明，试验各处理的病情指数均低于清水对照，其中防效最好的是处理②，及阳性对照处理①，防效分别达到72.62%和71.78%，高于其他4个处理，显示极显著差异。防效较好的还有处理④，为61.0%，高于处理③(31.49%)、⑤ (35.26%)和⑥ (23.17%)的防效，差异极显著。综上表明，发酵液在浓度较高时，对小麦赤霉病有较好防效，但随着发酵液浓度降低，防效迅速下降。MT-06孢子液中加入2 mg·mL-1甲霜锰锌后，防效极显著地高于MT-06孢子液的处理，达到甚至超过了阳性对照4 mg·mL-1甲霜锰锌的处理，但差异不显著。表明菌药混配可在不影响防效的情况下减少农药的使用量。

表2 MT-06及菌药混配对小麦赤霉病防治效果

3 小结和讨论

在确定MT-06对禾谷镰刀菌具有抑制作用的基础上，研究了MT-06的发酵条件，表明在PDB液体培养基中，5%接种量，28℃，150 r·min-1条件下，随着培养时间的增加，发酵液的抑菌效果增强，到第14天时达到峰值。随着培养时间延长，发酵液的抑菌效果逐步减弱，到第28天后，抑制率曲线趋于平缓。由此推测，MT-06的发酵产物中，具有抑菌活性的组分不止一种，既有易于降解的活性组分，也有性质较稳定的组分。本文初步探明了MT-06发酵液的萃取方法，获得了具有抑菌活性的粗提物，有关活性物质的成分分析及其作用机制还有待进一步研究。

由于单独使用生防菌存在效果不稳定和疗效慢等缺点，采用化学农药与生防菌混配防治病害，具有一定的可行性［11］。化学农药可弱化病原菌，从而有利于生防菌对于病原菌的侵入与抑制［12］。本实验室通过前期的室内生测试验，筛选出了甲霜锰锌对小麦赤霉病菌具有强烈抑制作用，而对生防菌MT-06的影响相对较小。故开展了甲霜锰锌与生防菌MT-06混配防治小麦赤霉病的田间小区试验，结果显示，生防菌孢子液中加入一定量的化学杀菌剂后，大幅增强了防治效果。1996年 Kantan［13］提出用农药弱化病原菌的方法提高生防效果。经过化学农药对植物致病菌的弱化，生防菌定植于病原菌的能力增强，使得生防菌在与病原菌的对抗中占优势，并长期发挥作用。本文的研究结果与该报道一致，但其弱化的作用机制还有待研究。小区试验还表明，MT-06与农药混配，可在保证相同防效的基础上，降低农药的使用量，这为生防菌的开发利用提供了更多的思路。MT-06发酵液的田间使用对小麦赤霉病也有较好防效，但高效的发酵工艺及与化学杀菌剂的混配使用等问题还有待深入探讨。

［1］ 韩青梅，曹丽华.小麦赤霉病的生物防治研究进展 ［J］.麦类作物学报，2003，23(3):128-131.

［2］ Champeil A，DoreT，FourbetJ.Fusarium head blight:epidemiological origin of the effects of cultural practices on head blight attacks and the production of mycotoxins by Fusarium in wheat grains［J］.Plant Science，2004，166(6):1389-1415.

［3］ 宋迎波，陈晖，王建林.小麦赤霉病产量损失预测方法研究 ［J］.气象，2006，32(6):116-120.

［4］ Gilbert J A Tekauz.Recent developments in research on Fusarium head blight of wheat in Canada ［J］.Can J Plant Pathol，2000，22(1):1-8.

［5］ 余桂容，张敏.小麦赤霉病的生物防治研究:I.拮抗芽孢杆菌的分离、筛选、鉴定和防病效果［J］.四川农业大学学报，1998，16(3):314-318.

［6］ Zhao Z，Wang Q，Wang K，et al.Study of the antifungal activity of Bacillus vallismortis ZZ185 in vitro and identification of its antifungal components ［J］.Bioresource Technology，2010，101(1):292-297.

［7］ Henkes G J，Jousset A，Bonkowski M，et al.Pseudomonas fluorescensCHA0 maintainscarbon delivery to Fusarium graminearum-infected roots and prevents reduction in biomass of barley shoots through systemic interactions［J］.Journal of Experimental Botany，2011，62(12):4337-4344.

［8］ Goh Y K，Vujanovic V.Sphaerodes quadrangularis biotrophic myco-parasitism on Fusarium avenaceum ［J］.Mycologia，2010，102(4):757.

［9］ 魏彩燕，毛雪琴，柴荣耀，等.草莓炭疽病生防菌株MT-06的鉴定及生物学特性［J］.菌物学报，2010，29(4):481-487.

［10］ 唐启义.DPS数据处理系统［M］.北京:科学出版社，2010.

［11］ Morales-Rodriguez A，Peck D C.Synergies between biological and neonicotinoid insecticides for the curative control of the white grubs Amphimallon majale and Popillia japonica ［J］.Biological Control，2009，51(1):169-180.

［12］ 陈斌，冯明光.两种杀虫真菌制剂与低用量吡虫啉对温室粉虱的协同防效评价 ［J］.应用生态学报，2003，14(11):1934-1938.

［13］ Kantan J， Elad Y， Ched I. Pathogen weakeningasa component ofintegrated control［A］.In:Advancesof Biological Control of Plant Disease［C］.China Agricultural University Press，1996:321-326.