替米沙坦对东莨菪碱模型小鼠学习记忆及脑内胆碱能神经的影响

李冰，王浩，洪浩 （.安庆市立医院，安徽 安庆46003；.中国药科大学药理教研室，江苏 南京0009）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种以认知记忆功能进行性减退为主要临床表现的一种致死性神经退行性疾病，其主要病理特征是β淀粉样蛋白（Aβ）沉积和脑内胆碱能神经缺失［1－2］。AD发病率随着人类现代化和老年化进程的加速而逐年攀升，并且有不断年轻化的趋势，给家庭和社会面带来沉重的负担。目前临床上治疗药物的种类和疗效十分有限，而市场需求逐年增加［2］。因此，寻找更有效的防治AD的药物具有重要意义。替米沙坦是1型血管紧张素Ⅱ受体（AT1R）拮抗剂，临床上常用于治疗高血压病。近些年来，文献不断报道，AT1R 拮抗剂如缬沙坦、氯沙坦、替米沙坦等可显著改善转基因痴呆模型小鼠或Aβ诱导的痴呆模型动物学习记忆损害［3］，但AT1R拮抗剂是否可以通过提高中枢胆碱能神经系统功能改善学习记忆损害目前尚未见文献报道。本研究采用东莨菪碱诱导的痴呆模型，探究替米沙坦对对东莨菪碱模型小鼠学习记忆及脑内胆碱能神经的影响，为进一步研究AT1R拮抗剂防治AD奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 Morris水迷宫（上海吉量软件科技有限公司）；MG－3S型Y 迷宫刺激器（淮北正华生物仪器设备有限公司）；16／18 型紫外／可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；酶标分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）。

1.2 药物与试剂 盐酸替米沙坦（telmisartan，Tel，江苏亚邦爱普森药业有限公司，批号1105012）；东莨胆碱注射液（scopolamine，Sco，上海禾丰制药有限公司，批号120503）；盐酸多奈哌齐（安理申，aricept，Ari，卫材（中国）药业有限公司，批号110208A）；羧甲基纤维素钠（CMC－Na，国药集团化学试剂有限公司，批号20091221）；乙酰胆碱试剂盒、乙酰胆碱酯酶试剂盒及考马斯亮蓝试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 实验动物 ICR 小鼠，雄性，清洁级，体质量（20±2）g，共40只，由扬州大学比较医学中心提供，动物质量合格证号：SCXK（苏）2007－0001。

2 方法

2.1 分组、模型建立及给药 取清洁级ICR 小鼠40只，体质量18～22g，按体质量随机分为5组，即Sal＋Veh组、Sco＋Veh组、Sco＋Ari组、Sco＋Tel（0.70mg·kg－1）组、Sco＋Tel（0.35 mg·kg－1）组，每组8只。

Sco＋Veh组、Sco＋Ari组、Sco＋Tel（0.70mg·kg－1）组、Sco＋Tel（0.35mg·kg－1）组腹腔注射东莨菪碱（Sco，1.0mg·kg－1），Sal＋Veh组腹腔注射等体积的生理盐水（Sal）。30min后灌胃给药，Sco＋Ari组灌胃给予安理申（Ari，2mg·kg－1），Sco＋Tel（0.70mg·kg－1）组和Sal＋Tel（0.35mg·kg－1）组灌胃给予替米沙坦，Sal＋Veh组和Sco＋Veh组给予等体积的0.5% CMC－Na。腹腔注射和灌胃给药均每天1次，连续17d。

2.2 Morris水迷宫试验 给药第8天进行Morris水迷宫试验，为期6d，第1，2天为可见平台训练，第3，4，5天为隐藏平台训练，第6天为空间搜索试验。水迷宫试验期间每天继续给药，于灌胃给药30min后进行试验。（1）可见平台训练：将插有旗子的水迷宫平台（旗子高于平台5cm）置于水迷宫第4象限，放入25 ℃左右水至没过平台5mm。每天从1，2，3，4四个象限（4个入水点）分别将小鼠面向池壁放入水中，使其自由游泳90s，90s内小鼠找到平台并上台停留10s后将其从平台上取下休息，计算机监测并记录小鼠从入水开始至爬上平台所需的时间（潜伏期）及穿越平台的次数等数据。若90s内动物未找到平台，则将小鼠引到平台，并停留30s，潜伏期记为90s。（2）隐藏平台训练：将未插有旗子的水迷宫平台置于水迷宫第4象限，放入25℃左右水至没过平台5 mm。训练方法同可见平台训练。（3）空间搜索试验：试验第6天撤除平台，任选一象限将各组小鼠依次从该象限面向池壁放入水中，使其自由游泳90s，记录小鼠在第4象限停留的时间占总时间的百分比（行为学测试过程中应保持光线柔和，房间安静，各参照物位置不变）。

2.3 Y 迷宫试验 Morris水迷宫试验后进行Y 迷宫试验，Y 迷宫电压设置10V，电击延迟时间为2 s，试验为期2d，第1天为训练，首先将小鼠放入Y迷宫，适应环境5min，然后将小鼠置于某一臂作为起点区，进行电击，其一次逃至安全区为正确反应，否则记为错误反应。电击每次间隔30s，依次重复，连续训练10 次。第2 天为测试，此次无需适应5 min，实验操作和方法同第1天，记录小鼠在连续10次电击中的正确逃避次数。

2.4 小鼠脑组织海马区和皮层区乙酰胆碱（ACh）及乙酰胆碱酯酶（AChE）含量测定 将小鼠断头取脑，用预冷生理盐水冲洗表面血液，分离海马和皮层，取一部分样本以质量／体积比1∶9加入裂解液，制成约10%匀浆，3 500r·min－1、4 ℃离心15min，取上清液，按试剂盒说明规定的方法测定ACh 含量。另一部分样品以质量／体积比1∶9加入4 ℃生理盐水，制成约10%的匀浆，3 500r·min－1、4 ℃离心15min，取上清液，按试剂盒说明规定的方法测定AChE含量。并用考马斯亮蓝定量蛋白。

3 结果

3.1 Morris水迷宫试验 在可见平台训练中，各组小鼠的训练潜伏期无显著差异（P＞0.05，n＝8），见图1，说明各组小鼠对目标的识别能力和色觉均正常。在隐藏平台试验中，试验第2 天，Sal＋Veh组和Sco＋Ari组潜伏期均小于Sco＋Veh组，具有统计学意义（P＜0.05，n＝8），试验第3 天，Sco＋Tel（0.70mg·kg－1）组和Sco＋Tel（0.35mg·kg－1）组小鼠的潜伏期均小于Sco＋Veh 组，具有统计学意义（P＜0.01，n＝8），见图2。在空间探索试验中，Sco＋Tel（0.70mg·kg－1）组和Sco＋Tel（0.35mg·kg－1）组小鼠在原平台所在象限停留时间百分率及穿越平台次数均显著大于Sco＋Veh组（P＜0.05，P＜0.01，n＝8），见图3～5。

3.2 Y 迷宫试验 如图2所示，Sco＋Tel（0.70mg·kg－1）组和Sco＋Tel（0.35 mg·kg－1）组较Sco＋Veh组正确反应次数显著增加（P＜0.05，P＜0.01，n＝8），见图6。

Morris水迷宫和Y 迷宫试验结果提示，替米沙坦（0.35～0.70 mg·kg－1）对东莨菪碱模型小鼠学习记忆损害有显著改善作用。

3.3 替米沙坦对东莨菪碱模型小鼠脑内乙酰胆碱（ACh）及乙酰胆碱酯酶（AChE）的影响 与Sco＋Veh组比较，Sco＋Tel（0.70mg·kg－1）组和Sco＋Tel（0.35mg·kg－1）组小鼠脑组织海马区和皮层区ACh含量显著增多（P＜0.05，P＜0.01，n＝4），而AChE活力显著下降（P＜0.05，n＝4）（表1），提示，替米沙坦可抑制东莨菪碱模型小鼠脑内AChE 活性，提高ACh含量。

表1 各组小鼠海马及皮层ACh及AChE含量比较（U·mgprot－1，±s，n＝4）Tab 1 Comparison of the ACh and AChE content in mice’s hippocampus and cortex of each group（U·mgprot－1，±s，n＝4）

表1 各组小鼠海马及皮层ACh及AChE含量比较（U·mgprot－1，±s，n＝4）Tab 1 Comparison of the ACh and AChE content in mice’s hippocampus and cortex of each group（U·mgprot－1，±s，n＝4）

注：A.Sal＋Veh；B.Sco＋Veh；C.Sco＋Ari／2 mg·kg－1；D.Sco＋Tel／0.70mg·kg－1；E.Sco＋Tel／0.35mg·kg－1。与Sco＋Veh组比较，aP＜0.05，b P＜0.01

4 讨论

基底前脑胆碱能神经元退变、丢失是AD 患者学习记忆损害的主要原因之一，ACh及其受体在调节学习记忆活动中发挥着十分重要的作用。提高ACh及其受体功能的药物如胆碱酯酶抑制剂（多奈哌齐、利斯的明等）是目前临床上治疗AD 的一类重要药物［2］。东莨菪碱为非选择性M 受体阻断剂，可以通过血脑屏障进入中枢，阻断中枢ACh与其受体的结合，破坏大脑皮层和海马等部位的胆碱能神经信号传递，使学习记忆功能下降［4］。东莨菪碱用于诱导动物记忆损害模型具有简单、经济、方便等优点，故常应用于抗AD 活性化合物的初步筛选［5］。AT1R 拮抗剂替米沙坦脂溶性较高，较其他AT1R拮抗剂更易通过血脑屏障［6］。值得注意的是，我们使用的替米沙坦剂量非常低（0.35～0.70mg·kg－1·d－1），仅相当于抗高血压剂量的1／60～1／30，因此，替米沙坦改善东莨菪碱模型小鼠学习记忆损害的同时不影响血压［6－8］。本研究发现，替米沙坦通过降低AChE活性提高胆碱能神经递质ACh含量，改善东莨菪碱模型小鼠学习记忆损害。替米沙坦是怎样降低AChE 活性尚不清楚，有可能直接抑制AChE活性，也有可能通过阻断AT1R 下调AChE表达。此外，替米沙坦还是一个PPARγ部分激动剂。激活PPARγ也可能是替米沙坦改善东莨菪碱模型小鼠学习记忆损害机制之一［5］。

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