高效液相色谱法测定红细胞中胆固醇的含量

郭建芳，田振虎，朱萍，张砚敏，陈萍 （.陕西中医学院，陕西 咸阳7046；.陕西省中医药研究院，陕西 西安70003）

近年来的研究表明［1－2］，红细胞中胆固醇与多种疾病如冠心病、原发性高血压、糖尿病、肝脏疾病等的发生、发展有着密切的联系，与血浆中胆固醇的含量相比，红细胞中胆固醇含量的变化更能直接的反应机体的病理变化，对疾病的预测和检验有着更为重要的作用。因此，体外检测红细胞中胆固醇水平作为了解其与某些疾病关系的重要手段而日益受到重视，与之相应的检测方法也随着科学技术的发展而不断的发展和进步。红细胞中胆固醇测定方法主要为酶联试剂显色法［3］、化学修饰电极测量法［4］等，未见高效液相色谱法检测红细胞中胆固醇含量的文献报道。

1 材料

2690高效液相色谱仪（Waters公司），996型二极管阵列检测器；BP211D 型电子天平（Sartorius公司）；KQ－250DE型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；超纯水机（Millipore 公 司）；乙 腈（HPLC 级，Fisher 公 司）；异 丙 醇（HPLC级，天津市科密欧化学试剂有限公司）；正己烷（AR级，广东光华科技股份有限公司）；氯化钠（AR 级，西安化学试剂厂）；胆固醇对照品（中国食品药品检定研究院，批号111618－200301）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Boston Green ODS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）120 A；乙腈－异丙醇（85∶15）作为流动相，等度洗脱；流速为1.0mL·min－1；检测波长为210 nm，柱温为室温；进样量20μL。进样前均以0.45μm微孔滤膜过滤。

2.2 溶液的制备 （1）对照品溶液：取胆固醇对照品适量，精密称定，于棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL 含94.512μg的溶液，即得对照品溶液。（2）供试品溶液：取1 mL 抗凝血，在2 500 r·min－1离心10 min，去上清，取下层沉淀用等体积生理盐水洗涤2 次，去上清，沉淀加入KOH 饱和溶液1 mL，甲醇5 mL，40 ℃超声皂化1 h。上述溶液中加入15%三氯醋酸沉淀蛋白质，静置2 h。加入正己烷－异丙醇（3∶1）的混合溶液5 mL，超声30 min提取，重复3次，合并提取液。将提取液用纯化水洗涤至中性，挥干，用2 mL 甲醇溶解，即得。（3）空白溶液：取纯化水1 mL，按照供试品溶液的制备方法制备，即得。

2.3 方法与结果［5］

2.3.1 专属性考察 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、空白溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，见图1。

图1 对照品（A）、供试品（B）和空白溶液（C）的HPLC色谱图1－胆固醇Fig 1 HPLC chromatograms of reference substance（A），sample（B）and blank solvent（C）1－cholesterol

2.3.2 定量限 取对照品溶液（393.8μg·mL－1），进样1 μL，记录色谱图。并对色谱系统进行基线检测，以基线噪声的10倍为定量限，结果测得定量限为393.8 ng（S／N＝10）。

2.3.3 线性关系考察 精密称取对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释成每1 mL含393.8μg的溶液。再以此溶液稀释成每1 mL 含19.69，59.07，118.14，177.21，295.35μg的 溶液，精密吸取上述溶液20μL注入液相色谱仪，测定，以对照品峰面积Y 对质量浓度X（μg·mL－1）进行线性回归，得回归方程为：Y＝4 418.4 X－39 172，r＝0.999 8。

2.3.4 精密度试验 取对照品溶液、供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，测得对照品和供试品溶液峰面积的RSD 分别为1.78%，1.21%，表明该方法精密度良好。

2.3.5 稳定性试验 精密吸取供试品溶液20μL，按“2.1”项下色谱条件，分别于0，3，6，9，12，18，24，36，48 h进样，测得峰面积RSD 为1.85% （n＝9），表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.3.6 重复性试验 取同一批次的样品，按“2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件测定。结果测得平均含量为389.08μg·mL－1，RSD 为1.46% （n＝6）。表明该方法重复性良好。

2.3.7 回收率试验 取已知含量的血样9份，每份1 mL，分离出红细胞后，分成3 组，分别精密加入含胆固醇393.8 μg·mL－1的对照品溶液0.3，0.6，1.2 mL，按“2.2”项下方法制备供试品溶液。按“2.1”项下色谱条件测定，分别计算低、中、高3组浓度下的平均回收率、总平均回收率和总RSD，结果见表1。试验结果表明，该方法具有良好的回收率。

表1 回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.3.8 样品测定 分别取血样3份，按“2.2”项下方法制备红细胞供试品溶液。另取血样3份，每份1 mL，加入KOH饱和溶液2 mL，甲醇10 mL，40 ℃超声皂化1 h。其余参考“2.2”项下方法。制备全血的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算每1 mL血中红细胞胆固醇含量以及1 mL血中胆固醇含量。结果见表2。

表2 胆固醇含量测定结果（n＝3）Tab 2 Results of determination of cholesterol（n＝3）

3 讨论

3.1 红细胞的分离考察 全血经过离心［6］后可将红细胞与血浆分离，试验证实用等体积（红细胞）的生理盐水清洗，第2次洗液中几乎不含胆固醇，第3次洗液未检出胆固醇，因此确定红细胞洗涤2次，即可完全去除血浆。

3.2 胆固醇皂化条件筛选 本试验采用单因素试验对皂化温度、皂化时间进行了考察，结果皂化温度为40 ℃，皂化时间为1 h的条件下可达到最佳皂化效果，皂化完成后溶液澄清无沉淀物。

3.3 胆固醇提取工艺筛选 本试验采用了L9（34）正交试验，对提取溶剂、提取次数、提取时间进行考察。其中提取溶剂的种类在预试验中已经确定为正己烷和异丙醇的混合溶剂，本次正交主要是针对有机溶剂中正己烷和异丙醇的比例进行调整，结果表明，有机溶剂的比例差异对提取效果无明显差异（P＞0.05），提取次数和提取时间的不同对提取效果有显著性的差异（P＜0.05），最终选取提取溶剂为正己烷－异丙醇（3∶1），提取3次，每次30 min的条件为最佳提取条件。

3.4 色谱条件的筛选 参考文献［7］，通过试验确定流动相组成。流动相比例为乙腈∶异丙醇（70∶30／80∶20）时，虽然分析时间短，但不能完全分离胆固醇和其他杂质，故最终确定为乙腈－异丙醇（85∶15）。测定波长方面，虽然对照品紫外扫描最大吸收波长为在203 nm，但为避免溶剂的干扰，最终采用210 nm 作为测定波长。

3.5 质量控制 本文采用高效液相色谱法对红细胞中的胆固醇含量进行了检测，能分离胆固醇及其杂质，比传统的测定总胆固醇的方法更客观、准确。

［1］ 刘汝胜，席文华.冠心病患者中红细胞膜总胆固醇含量（CEM）水平的变化分析［J］.中国保健营养，2012，10（2）：3714－3715.

［2］ 郑才岳.红细胞胆固醇测定及其临床意义［J］.人民军医，

1995，2：51－53.

［3］ 周君富.酶法快速测定红细胞胆固醇含量［J］.浙江医科大学学报，1993，22（4）：152－155.

［4］ 吕大伦，崔凡，陶绍能，等.严重烧伤对红细胞膜胆固醇含量及红细胞滤过指数的影响［J］.中国急救医学，2002，22（2）：70－71.

［5］ 中国药典.二部［S］.2010：附录194.

［6］ 吴钰珩，黄民，汤丽芬，等.一种简易检测人红细胞中6－硫鸟嘌呤浓度的HPLC法［J］.药物分析杂志，2002，22（2）：237－239.

［7］ 邹凤萍，熊鸣，余琼卫.等.高效液相色谱检测巨噬细胞内胆固醇的研究［J］.分析科学学报，2007，23（6）：647－650.