脂肪酶活力测定方法及其在筛选产脂肪酶微生物中的应用

王欢 何腊平 周换景 张义明 李翠芹 陶菡

（1.贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵阳 550025；2.贵州大学化学与化工学院，贵阳 550025；3.贵州大学生命科学学院，贵阳 550025；4.贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵阳 550025）

脂肪酶（甘油三酯水解酶，EC 3.1.1.3）是由动植物及微生物产生的能在水-油界面催化甘油三酯水解的酶，而且在非水相介质中可催化酯合成反应。其中，微生物脂肪酶由于其稳定性、选择性及底物特异性在商业应用方面显示出巨大的潜能［1，2］，所以有效筛选产脂肪酶微生物具有重要意义。

微生物筛选的关键问题是如何构建高效筛选模型，而在筛选合适的生物催化剂之前要测定其活力大小。目前关于脂肪酶活力的测定，常用的实用方法主要有：测其水解酶活力的方法，如平板法［3］、橄榄油乳化法［4，5］、对硝基苯酚法［6-8］等；测其酯合成酶活力的，如对硝基苯酚法测脂肪酶酯合成酶活力［9］等。因为测定方法的选择是否合适直接关系到有效筛选到产脂肪酶的微生物的可能性，所以本研究旨在探讨筛选产脂肪酶微生物的最佳方法。

基于此，本研究就目前常用的罗丹明平板法，橄榄油乳化法，对硝基苯酚法测脂肪酶水解酶活以及对硝基苯酚法测脂肪酶酯合成酶活几种脂肪酶活力测定方法进行了比较试验，并对其在筛选产脂肪酶微生物中的相应应用进行了探讨，以期更好地服务于实践应用。

1 材料与方法

1.1 材料

Novozyme 435（诺维信脂肪酶）由 Novo Nordisk，Bagsvard，Denmark赠送。脂肪酶lipase AY由Amano酶制剂公司赠送，脂肪酶PPL（Pocine Pancreas Lipas）由Sigma-Aldrich Chemical Co.购买。本试验所用微生物来自于贵州大学贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室和贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室保藏菌种。对硝基苯酚（ρ-NP）和4-硝基苯基棕榈酸酯（ρ-NPP）标样自百灵威科技有限公司购买。其他试剂均为分析纯或者商业用途。

1.2 方法

1.2.1 脂肪酶活力测定法 罗丹明平板法判断原理：罗丹明B能与脂肪酶水解的各种可能的底物（单、二油酸甘油酯，油酸，油酸钠）结合为聚合体，该聚合体受紫外光激活，产生橘黄色荧光［10］。依据有无橘黄色、颜色深浅和水解圈大小来判断是否产脂肪酶和对所产脂肪酶活力大小进行初步判断。

罗丹明平板法参考文献［3］。橄榄油乳化法参考文献［4，5］。对硝基苯酚法测脂肪酶水解酶活力法参考文献［6-8］。对硝基苯酚法测脂肪酶酯合成酶活力法参考文献［9］。

1.2.2 产高水解脂肪酶活力的微生物筛选中的脂肪酶活力测定方法

1.2.2.1 粗酶液及粗酶粉的制备 种子培养基（%）：牛肉膏0.3，蛋白胨0.5，葡萄糖0.5，NaCl 0.5，pH8.5，15 mL/250 mL三角瓶。发酵产酶培养基（%）：豆饼粉2.0，玉米浆 2.0，可溶性淀粉 1.0，K2HPO40.5，NaNO30.5，pH7.0，50 mL/250 mL三角瓶。

挑取一环新鲜的斜面种子，接入液体种子培养基中，37℃、150 r/min条件下培养24 h。然后取2 mL液体种子于发酵产酶培养基中，37℃、150 r/min条件下摇瓶培养72 h。将发酵液于4℃，8 000 r/min离心，上清液测酶活，沉淀经缓冲液洗涤后离心收集经冷冻干燥即为粗酶粉。

1.2.2.2 酶活测定 对实验室保藏的产脂肪酶菌种进行酶活测定，定性测定采用平板法，定量测定采用橄榄油乳化法和对硝基苯酚法测脂肪酶水解酶活。

1.2.3 产高酯合成酶活力的微生物筛选中的脂肪酶活力测定方法 粗酶液及粗酶粉的制备方法同

1.2.2.1。酶活测定：产水解脂肪酶活力高的菌株，需进行水解酶活力测定。筛选一般要进行初筛和复筛。初筛要注重数量，要有简单明了的判断方法，罗丹明平板法正符合要求；复筛要注重质量，要进行酶活力大小的测定，则需选用相应的定量测定方法。对实验室保藏的产脂肪酶菌种进行酶活测定，定性测定采用平板法，定量测定采用对硝基苯酚法测脂肪酶酯合成酶活。

2 结果

2.1 罗丹明平板法

将几株微生物接入罗丹明B培养平板中，于365 nm紫外灯下观察。结果如图1所示，有些菌落有橘黄色光，有些无，表明产橘黄色光的菌落产脂肪酶，否则不产脂肪酶或产脂肪酶活力可忽略。

由于罗丹明平板法简便易行，适用于初筛时对所筛选的微生物是否产脂肪酶做定性和初步定量判断，将用于后续筛选。

2.2 橄榄油乳化法

2.2.1 橄榄油乳化法与pH对应关系 用橄榄油乳化法测定不同pH值的脂肪酶活力，脂肪酶相对活力与pH对应关系如图2所示。结果表明，采用橄榄油乳化法测定脂肪酶活力，pH有较大影响，且不同脂肪酶的最适pH不同。

2.2.2 橄榄油乳化法测定精密度 采用橄榄油乳化法测定脂肪酶酶活力，结果见表1。

由表1可知，橄榄油乳化法所测结果变化较大，精确性和稳定性差。从误差来源分析，其指示剂终点变色范围大、不明显造成该方法稳定性差［11］。

2.3 对硝基苯酚法测脂肪酶水解酶活

对硝基苯酚法测脂肪酶水解酶活标准曲线（图3）显示，对硝基苯酚含量（x）为0-100 μmol/L时与吸光度（y）值呈现良好线性关系，回归方程为：y=0.17678x+0.00983，相关系数R2=0.99938。该图的试验数据标准差≤0.37%。

表1 橄榄油乳化法测得脂肪酶酶活及相对标准偏差

采用对硝基苯酚法测定脂肪酶水解酶活力，结果见表2。由表2可知，当酶活数值比较大时，精确度和稳定性比较高，但总体均优于橄榄油乳化法。

2.4 对硝基苯酚法测脂肪酶酯合成酶活

对硝基苯酚法测脂肪酶酯合成酶活标准曲线（图4）显示，对硝基苯酚含量（x）为-2 mmol/L时与吸光度（y）值呈现良好线性关系，回归方程为：y=6.12562x+0.01334，相关系数R2=0.99970。该图的试验数据标准差≤0.42%。

采用对硝基苯酚法测定脂肪酶酯合成酶活力，结果（表3）显示，当酶活的数值过大或过小时均影响测定的稳定性。

表2 对硝基苯酚法测脂肪酶水解酶活及相对标准偏差

表3 对硝基苯酚法测脂肪酶酯合成酶活及相对标准偏差

2.5 脂肪酶活力测定方法在产水解脂肪酶活力的微生物筛选的应用结果

2.5.1 初筛中的罗丹明平板法检测结果 从实验室保藏菌种中，利用罗丹明平板法筛选出了50株产脂肪酶微生物（其中部分是前期试验筛选出来保藏的），将具有变色圈的菌种挑出进行下一步试验。

2.5.2 复筛中的对硝基苯酚法测脂肪酶水解酶活检测结果 由于对硝基苯酚法比橄榄油乳化法测定脂肪酶水解酶活相对偏差要小，所以在复筛中选择对硝基苯酚法测定脂肪酶水解酶活。

粗酶粉采用对硝基苯酚法测脂肪酶水解酶活。测定结果（表4）表明，酶活高的菌株较少，其中酶活最高的菌株可达3.921 U/mL。上述结果说明可以通过罗丹明平板法初筛和对硝基苯酚法测脂肪酶水解酶活法筛选到水解酶活较高的产脂肪酶菌株。

表4 对硝基苯酚法测定水解酶活

2.6 脂肪酶活力测定方法在产高酯合成脂肪酶活力的微生物筛选的应用结果

初筛中的罗丹明平板法检测结果 同2.5.1。复筛中粗酶粉采用对硝基苯酚法测脂肪酶酯合成酶活，测定结果如表5所示，其中酶活最高的菌株为3.296 U/g。上述结果说明可以通过罗丹明平板法初筛和对硝基苯酚法测脂肪酶合成酶活法筛选到酯合成酶活较高的产脂肪酶菌株。

表5 对硝基苯酚法测定合成酶活

3 讨论

对上述测定方法进行比较，由于罗丹明平板法只适合于对脂肪酶做定性和初步定量判断，在这里比较上述后面3个定量检测方法。

3.1 精密度比较

总体来讲，对硝基苯酚法要比橄榄油乳化法相对标准偏差要小，重现性好。但是对于酶活较小的菌种，相对标准偏差较大，所以选择正确的酶活测定方法很重要。

3.2 酶活力大小比较

3种方法测得几种脂肪酶的酶活及相对标准偏差显示（橄榄油乳化法测定酶活时采用每种脂肪酶的最适pH值），3种测定方法在测定同一种脂肪酶时，测定结果在数值上有一定的差异，不能互相代替。橄榄油乳化法和对硝基苯酚法测定脂肪酶水解酶活时数据相差较大，其中对硝基苯酚法稳定性较好，尤其在测定有较大酶活的脂肪酶时。因此，在测定脂肪酶活力前，确定合适的稀释倍数尤为重要。

所测出酶活与脂肪酶所催化的反应有对应关系，Lipase AY主要催化甘油三酯的水解，Novozym 435主要催化酯合成反应，故Lipase AY的水解酶活最高，而Novozym 435的酯合成酶活最高。

3.3 水解酶活力及合成酶活力相关性比较

表3与表1、表2比较可知，脂肪酶的酯合成酶活力与水解酶活力一般并不一致，与文献［12，13］的报道一致。由此得出结论，如果目的是筛选脂肪酶水解酶活力高的菌株，就要用脂肪酶水解酶活测定方法进行测定；反之，就要用脂肪酶酯合成酶活测定方法进行测定。

今后的脂肪酶筛选可基于这一思路进行，对于这种选择测定方法的可行性再进行验证。

4 结论

（1）平板法快速、简单，适用于产脂肪酶菌株的筛选，但是精确度不足，并且需要的时间周期比较长。

（2）橄榄油乳化法方法简便、测定速度较快，但是重现性较差，可用于粗略的估计酶活大小。

（3）与橄榄油乳化法相比，对硝基苯酚法测水解酶活灵敏度有所提高，方法稳定、重现性好，有利于检测活力低的脂肪酶，是构建脂肪酶高通量模型的较好选择。

（4）对硝基苯酚法测合成酶活方法能比较好的衡量脂肪酶的合成能力，是筛选具有合成能力的脂肪酶的比较好的方法。

（5）脂肪酶的水解酶活和合成酶活力往往不一致，所以实际应用时应选用相应的测定方法。本研究也基于这一原则，分别成功地筛选到了脂肪酶水解酶活较高的菌株和脂肪酶合成酶活较高的菌株。

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