拟南芥RPS14基因的克隆表达及功能初步研究

范艳荣 刘莹 张飞云

（首都师范大学生命科学学院，北京 100048）

核糖体是合成蛋白质的重要细胞器，包括40S小亚基和60S大亚基。这些亚基分别有4种不同类型的RNA和80种结构不同的蛋白质组成。RPS14（Ribosomal protein S14）是40S亚基的组成成分，这个蛋白属于S11P核糖体蛋白家族［1］。根据已有研究，人类、酵母等真核生物体内的RPS14基因主要负责RNA转录后加工，如SSU-rRNA（small subunit rRNA）的加工成熟与组装，从而调控蛋白质的翻译过程。在中国仓鼠的卵巢细胞中，该基因的突变能导致产生蛋白合成抑制剂，抵抗催吐剂的合成。

拟南芥腺苷酸激酶6（Arabidopsis thaliana Adenylate kinase 6，AAK6）是一种腺苷酸单磷酸激酶，广泛存在于生物体中。AK6基因已在大多数动物，如人类、果蝇、线虫以及酵母中有了较深入的研究，近年来人们开始探究AK6基因在植物体内的特性与功能。以模式植物拟南芥为研究对象，已证实AK6蛋白具有腺苷酸激酶活性，能可逆地催化γ磷酸基团的转移（通常作用于ATP），使ATP和AMP反应生成两分子的ADP，以此来维持细胞内的能量平衡［2-4］。同时，脊椎动物、果蝇、酵母菌，以及植物细胞核中存在一种亚核结构柯浩体，它能够行使mRNA和rRNA前体的拼接和剪接功能。在对人类AK6基因（HAK6/CBRF）的初步研究表明，AK6基因定位于柯浩体上，故又称为柯浩体调节因子，其很可能在柯浩体上发挥重要作用，与真核细胞中核糖体的组装相关［5，6］。通过前期的研究，从aak6-/aak6-突变体植株与野生型植株的生长状况对比可以看出，突变体明显矮小［6，7］。

RPS14基因参与RNA的转录后加工过程，推测其可能影响植株的生长状况。本研究拟用体外pulldown技术，并结合SDS-PAGE和Western blot检测，旨在探究拟南芥中RPS14蛋白与AK6蛋白是否存在相互作用，找到植株矮化的内在线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 pEASY-T3、pGEX-6P-1载体、pET-28a载体、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α与TOP10、BL21（DE3）均为本实验室保存。

1.1.2 试剂 Trizol试剂购自美国TEL-TEST Inc。常用化学无机盐等试剂均为北化分析纯试剂。逆转录试剂盒购自Fermerters公司。高保真PCR试剂盒、随机引物购自上海生工生物工程公司。T-A cloning 试剂盒购自全式金公司。各种构建载体所需工具酶（如限制性内切酶、T4连接酶等）购于TaKaRa公司。质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自QIN-GEN公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取与检测及反转录 以拟南芥的叶片为材料，用Trizol法提取RNA，并用反转录试剂盒反转录成cDNA。

1.2.2 RPS14基因的扩增 根据GenBank中2g36160序列利用PrimerPremier5.0设计引物，上游EcoR I 酶切位点，下游加入Xho I 酶切位点，引物序列为：

上游引物：5'-GAATTCATGTCAAAGAGAAAGACTAAAGAGC-3'；下游引物：5'-CTCGAGTCAGAGCCTTCTTCCTCTTCTAC-3'。

以制备好的拟南芥cDNA为模板，扩增体系为20 μL反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃ 5 min。反应结束后，取出5 μL进行电泳，检测是否扩增出目的片段，检测到目的片段后用胶回收试剂盒进行回收。

1.2.3 原核表达质粒的构建和鉴定 将纯化后的PCR产物和pEASY-T3连接，用限制性内切酶 EcoR I和Xho I进行双酶切，胶纯化以后将PCR产物与pGEX-6P-1线性片段连接，16℃连接过夜，连接体系如表1所示。

表1 PCR产物与pGEX-6P-1线性片段连接体系

将连接产物转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，37℃活化1.5 h后涂LB Amp抗性平板，置37℃倒置培养。转化后，用抗生素筛选后的单克隆进行如下程序检测：菌落PCR筛选—测序，最终找出正确的重组克隆。

1.2.4 重组蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化 将测序结果正确的重组质粒分别转化BL21（DE3）感受态细胞表达菌株，用0.5 mmol/L的IPTG诱导，16℃ 23 h。5 000 r/min，30 min离心，弃上清。用5 mL PBS悬浮沉淀。然后超声破碎，4℃ 12 000 r/min 离心30 min，收集上清，上清和沉淀分别留少许进行SDS-PAGE检测。在上清中加入适量GST beads，4℃旋转令其吸附蛋白2.5 h；2 000 r/min，3 min离心弃上清；加入至少50 mL PBS，轻摇至beads悬浮于溶液中，2 000 r/min，3 min离心，弃上清；重复用PBS洗beads两次； 加入1 mL GST Elution Buffer，轻摇10 min；2 000 r/min，3 min离心，收集上清；重复用GST Elution Buffer洗两次，收集上清进行SDSPAGE检测。通过SDS-PAGE电泳检测。

1.2.5 过表达的拟南芥AK6蛋白的获得 AK6引物：上游引物：5'-GGAATTCCATATGGCGAGACGTAACCGTGGG-3'（Nde I）；下游引物：5'-CGGGATCCTCAGGGTTGCCATGCATTA-3'（BamH I）。其 他 方 法 同RRS14蛋白的制备。

1.2.6 体外pull-down寻找与RPS14相互作用的蛋白及免疫检测 用50 μL GST beads和1 mL GST-RPS14蛋白在4℃孵育，将过表达的HIS-AK6蛋白混合液加入经处理的GST beads中，在4℃旋转混合孵育2 h，用冰冷的细胞裂解液洗涤重复洗3次，SDS-PAGE检测。取胶，在冰浴中转PVDF膜2 h，将膜从电转槽中取出，用去离子水与PBST稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡1 h。加含HIS-Tag标签的一抗，4℃摇动孵育2 h。用PBST洗膜3次，每次5-10 min。加入相应的二抗后，用PBST再洗膜3次，每次5-10 min。最后进行自显影。

2 结果

2.1 总RNA的提取及反转录

用Trizol从拟南芥的叶片中提取RNA，根据检测的浓度利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，保存在-20℃备用，结果如图1所示。

利用特异的上下游引物通过PCR程序从拟南芥cDNA中扩增目的条带，1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的PCR产物，结果（图2）表明获得了与预期片段大小相符的清晰的目的条带。

2.2 原核重组表达质粒的构建和鉴定

将切胶回收的目的基因PCR产物与pEASYT3载体连接，用限制性内切酶EcoR I和Xho I 37℃双酶切pEASY-T3-RPS14和pGEX-6P-1，结果（图3）显示连接成功。把切下的目的基因和双酶切后的pGEX-6P-1载体16℃过夜连接，转化，挑取健壮的单克隆摇菌，用菌液PCR检测出单一条带，结果（图4）显示为阳性菌株。将阳性菌株菌液送去测序。测序结果与NCBI的相关序列比对完全正确。

2.3 原核重组表达载体的表达、可溶性分析及蛋白纯化

将测序正确的重组质粒分别转化到BL21（DE3）中，分别挑取健壮的单克隆培养至OD600=0.6，加入诱导剂IPTG在16℃诱导23 h；5 000 r/min，30 min离心，弃上清。用5 mL PBS悬浮沉淀。然后超声破碎，上清和沉淀用SDS-PAGE检测，如图5-A所示。蛋白纯化后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测得到比较单一的条带，结果如图5-B所示。

2.4 过表达拟南芥AK6蛋白

获得AK6蛋白需构建原核表达质粒pET-28a-AK6，其中pET-28a中带有HIS标签，便于后续试验中进行Western blot以鉴定AK6蛋白的存在，从而证明拟南芥中RPS14蛋白与AK6蛋白发生相互作用。

2.5 核糖体组成蛋白RPS14可能与AK6相互作用

将纯化后的HIS-AK6和GST-RPS14融合蛋白与GST beads共同孵育，经离心收集洗脱复合物和洗涤后，再加入过量GSH获得相互作用蛋白的复合物，去上清用SDS-PAGE检测（图6）。取胶，在冰浴中转PVDF膜2 h，最后进行自显影。

Western blot检测结果（图7）显示，凝胶泳道1转移膜上出现明显目的条带，且条带位于约26 kD处；而对照组凝胶泳道2转移膜上无目的条带出现。由于试验组pull-down收集的上清液蛋白中，只有AK6融合蛋白带有HIS标签，免疫检测加入识别HIS标签的抗体，使HIS-AK6融合蛋白与之结合，最后显色位置进一步证明上清液蛋白中确实存在AK6蛋白，并确定SDS-PAGE结果中出现的26 kD处条带是AK6蛋白，从而也进一步证明拟南芥中RPS14蛋白与AK6蛋白确实存在相互作用，共同调控细胞能量代谢平衡，这在AK6缺失导致拟南芥生长矮化的机制中可能发挥了重要作用。

3 讨论

拟南芥腺苷酸激酶6（AA6）是P-loop激酶家族成员，该激酶家族具有典型、保守的Walk A和Walk B结构域，其中Walk A结构域能够结合NTP分子，Walk B结构域能够结合重要的辅因子Mg2+，能使NTP+NMP=2NDP。核苷酸的平衡对多种细胞内的功能非常重要，如细胞内能量的代谢及DNA和RNA的合成等。

由于AK6是腺苷酸激酶，在体外试验中，除酵母外，人类、线虫、果蝇AK6的同源蛋白都具有激酶活性［8，9］，能使所有类型的NTPs和dNTPs充当磷酸供体，最适磷酸供体是ATP和dATP。同时，与拟南芥野生型植株相比，aak6-/aak6-纯合突变体植株表现出明显的矮化［10］，暗示AK6基因的缺失影响了细胞的形态和生长。

研究发现，酵母RPS14蛋白C端精氨酸突变成丙氨酸时，与Fap7（AK6的同源蛋白）缺失的表型相似，证实YAK6（Fap7）能与核糖体蛋白质RPS14互作，共同促进20S rRNA前体中D位点的剪接过程，使20S rRNA前体剪接为成熟的18S rRNA，再进一步组装为40S核糖体小亚基。如果把Fap7上Walk A和Walk B 结构域中几个保守的氨基酸突变以后，能明显抑制20S rRNA前体的剪接和细胞的生长［11］，说明RPS14基因对RNA的编辑起重要作用。

推测在拟南芥中，RPS14和AK6也可能存在相互作用。将GST空载，GST-RPS14融合蛋白和HISAK6融合蛋白在细菌中过表达，并亲和层析纯化。将纯化后的GST空载，GST-RPS14蛋白分别与HISAK6蛋白在冰上同GST beads孵育，纯化的GST空载作为负对照。用SDS-PAGE检测，结果显示GSTRPS14和HIS-AK6特异性的结合，而负对照组不发生结合。Western blot进一步证实GST-RPS14和HISAK6在体外有相互作用。

4 结论

本研究选用模式植物拟南芥作为试验材料克隆了RPS14基因和AK6基因，并获得其可溶性蛋白GST-RPS14和HIS-AK6。运用体外GST pull-down技术得出，拟南芥 RPS14蛋白与AK6蛋白存在相互作用。

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