牛FATP1基因5'侧翼启动子克隆及序列分析

龚婷 许厚强 陈伟 赵佳福 骆衡 陈祥 张勇

（1. 贵州大学 高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室，贵阳 550025；2. 贵州大学 贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵阳 550025）

脂肪酸转运蛋白1（Fatty acid transporter protein，FATP1），全称长链脂肪酸转运蛋白1，又名SLC27a1（Solute carrier family 27 member 1），是脂肪酸转运蛋白家族（Fatty acid transport family proteins，FATPs）的一员。脂肪酸转运蛋白家族目前已发现了6个亚型，即FATP1-FATP6［1］。不同亚型的FATP均含有311个高度保守的氨基酸信号序列和一段一磷酸腺苷（AMP）结合序列。大量研究证实FATPs的主要生理功能是促进长链和极长链脂肪酸进入细胞内，并根据代谢需要较快地协调游离脂肪酸的摄取，从而间接影响脂质分布与沉积，对动物肉质的改良有着非常重要的意义［2］。

FATP1是该家族中发现最早的基因，主要分布在脂肪组织和肌肉组织中，其表达具有组织特异性［3］。该基因1994年首次在小鼠3T3-L1脂肪细胞中发现，并证实其参与长链脂肪酸的合成和脂肪代谢［4］。进一步研究表明，FATP1基因引导外源性脂肪酸进入细胞，参与脂肪酸的摄入和酯化［5］。而且该基因在参与脂肪代谢的同时也参与能量代谢。2009年，Sebastian等［6］证 实，FATP1基 因 与 线粒体相关且对肌肉细胞线粒体脂肪酸氧化起作用。Wiczer 等［7］研究发现，FATP1基因有调控三羧酸循环活性及线粒体代谢的功能。同年，Guitart 等［8］通过亚细胞成分免疫印迹和FATP1-GFP融合蛋白的免疫细胞学发现，FATP1定位于线粒体中，并能提高丙酮酸脱氢酶的活性。Mitchell 等［9］转染FATP1 siRNA与HEK293细胞，发现FATP1能够调控心脏磷脂的重新合成。综上所述，FATP1基因是影响脂肪酸转运代谢和能量代谢的关键因子。

目前对于牛FATP1基因的表达和分子机理方面的研究还不是很多，启动子作为真核生物基因表达调控的顺式作用元件，含有基因表达调控网络的重要信息，决定基因表达的强度及特异性［10］。因此，本研究从牛FATP1基因的启动子入手，通过设计特异性引物进行PCR扩增牛FATP1基因2 164 bp的启动子序列，将其产物与pMD19-T载体连接后，获得含FATP1基因启动子序列的亚克隆载体，以期对后续研究牛FATP1基因特异性转录调控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

克隆所需载体pMD19-T vector、限制性内切酶Kpn I、限制性内切酶Xho I、T4 DNA ligase、质粒DNA抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、DL10000 Marker、DL2000 Marker均购自于TaKaRa（中国，大连）有限公司。其它的化学试剂均为国产分析纯级别，而整个试验采用Milli-Q超纯水系统制成的超纯水作为试验用水。

本次研究所用关岭牛血样采于2011年12月17日贵州省安顺市西秀区幺铺镇屠宰场。用作感受态的大肠杆菌JM109为本实验室保存菌种。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据GenBank中收录的牛FATP1基因的mRNA （NM_001033625.2）与已经公布的牛基因组Blast比对，下载获得相应的启动子序列并利用Primer Premier 5.0软件设计引物。上游引物5'-GGGGTACCGCATCCCCACTCAACTAATAC-3'，下游引物5'-CCGCTCGAGCCACAG AGTCCTTTATTTGC-3'，带下划线的序列为引入的两个带保护碱基的酶切位点Kpn I和Xho I位点。用这对引物扩增2 164 bp （-1969-+194 bp）的5'侧翼序列，以转录起始点为0，以上为负，以下为正。引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司（中国，上海）完成。

1.2.2 PCR扩增 从血液中提取关岭牛的基因组DNA，以关岭牛的基因组DNA为模板进行扩增。PCR总反应体系为25 μL，其中模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O补至25 μL。扩增条件：94℃预变性 4 min；94℃变性40 s、64℃退火50 s、72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。反应结束后，用1.0%琼脂糖凝电泳检测PCR产物。

1.2.3 扩增产物的克隆及测序 用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化PCR产物，再将其与pMD19-T载体16℃连接过夜后，转化大肠杆菌JM109中，然后涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂糖平板上培养16 h，挑取单菌落接入LB液体培养基中培养，37℃ 200 r/min，培养12 h后提取质粒，进行酶切和PCR双重鉴定。选取阳性克隆进行测序，测序于TaKaRa（中国，大连）有限公司完成。将测定的结果与NCBI登录的牛FATP1基因启动子序列（NM_214286.1） 进行比对分析，以确定克隆结果。

1.2.4 启动子的序列分析及预测 利用网站Web Promote Scan Service （Bioinformatics and Molecular Analysis Section，Dan Prestridge）和Neural Network Promoter Prediction （Berkeley Drosophila Genome Project，M.G. Reese）预测转录起始位点［11］；使用在线分析软件TFSEARCH （Parallel Application TRC Laboratory，RWCP，Japan）和PROMO （Algorithms and Data Structures for Information，Retrival，Dom enec Farre）预测转录因子结合位点；应用VISTA （Genomics Division of Lawrence Berkeley National Laboratory and US Department of Energy Joint Genome Institute，Pachter Lior）软件进物种间序列比对，再用DNASTAR （DNSSTAR Software Company，Frederick Blattner）中 Megalign 程序进行进化树构建［12］。同时收集相关启子转录调控位点研究的文献，综合多方面信息判定牛FATP1基因5'侧翼区最具可能性的启动子序列。

2 结果

2.1 牛FATP1基因5'侧翼启动子序列的扩增

PCR产物经电泳检测，出现单一的目的条带，片段大小为2 164 bp与预期结果一致（图1）。

2.2 阳性克隆的双酶切和PCR检测

将氨苄抗性筛选的阳性克隆子双酶切，经电泳检测后，出现两条明显条带，T载体为2 692 bp，目的片段为2 164 bp（图2），片段大小与预期相一致。克隆载体PCR检测结果（图3），出现单一的目的条带，与预期相符初步判定T载体克隆成功，可以送予生物公司测序。

2.3 启动子测序结果Blast比对

利用NCBI网站上提供的Blast Sequences将测序结果（图4）和牛基因组进行对比分析（图5），结果表明两序列100%一致，说明牛FATP1基因5'端2 164 bp大小片段的克隆载体已构建成功，可进行后续试验。

图1 目的条带PCR扩增图

图2 promoter-T载体双酶切验证

图3 promoter-T载体PCR验证

图4 启动子克隆载体的测序结果

2.4 牛FATP1启动子序列分析

2.4.1 启动子转录起始点预测 利用软件Promoter Scan和Neural Network Promoter Prediction对牛FATP1基因2 164 bp 5'侧翼启动子序列进行生物信息学分析（图6）发现，分别在-1 912 bp、-1 412 bp、-1 132 bp、-211 bp位置预测到转录起始点（Transcription start sites，TSS），且发现该区域存在类似的TATA-box和多个CAAT-box与GC-box。

图5 启动子克隆测序结果的blast比对

2.4.2 启动子转录因子结合位点的预测 利用网站TESS （Transcriptional factor search system）和在线生物软件Promo （ALGGEN）与TFSEARCH （Parallel Application TRC Laboratory，RWCP，Japan）对牛FATP1基因5'侧翼区序列进行综合分析，预测潜在的转录因子结合位点。结果发现在2 164 bp （-1 969 bp-+164 bp）范围内存在丰富的转录因子结合位点，如甾醇调控元件结合蛋白（Sterol regulatory elementbinding protein，SREBP ） 、CCAAT增强子结合蛋白β（Enhancer binding protein β，C/EBP-β） 、糖皮质激素受体α（Glucocorticoid receptor α，GR-α）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（Peroxisomal proliferatoractivated receptor alpha，PAR-α） 、激活增强子结合蛋白2α（Activating enhancer binding protein 2 alpha，AP-2αA） 、特异性转化因子（Transformation-specific，c-Ets-1）、B细胞特异性激活蛋白（B-cell lineage specific activator，Pax-5）、TATA结合蛋白（TATAbinding protein，TBP）、垂体特异性转录因子1（Pituitary specific transcription factor 1，POU1F1） 等40个转录因子，详见表1。

表1 牛FATP1基因启动子区域潜在转录因子结合位点预测

图7 不同物种FATP1基因5'侧翼区的序列比对

2.4.3 不同物种FATP1基因5'侧翼区序列比对和进化树构建 对不同物种FATP1基因5'侧翼区序列进行序列比对，结果如图7所示。不同物种FATP1基因的转录起始点上游-263 bp- -174 bp区域保守性较强，同源序列主要集中在转录起始点上游-578 bp--93 bp区域，其中牛与人、大鼠、小鼠、狗同源性分别为74.1%、71.1%、72.0%、62.8%，在该区域中未发现与斑马鱼的同源序列。利用DNASTAR中的Megalign程序进行进化树构建，结果如图8所示，其中小鼠和褐家鼠聚为一类，再与牛聚为一类，再与人聚为一类，然后与猪聚为一类，再与狗聚为一类，最后与斑马鱼聚合。该进化树真实反应了物种间序列保守性和进化关系。

3 讨论

基因启动子区域在基因的表达调控过程中发挥着重要的作用，各种转录因子能够识别基因5'调控区的特异位点并与之作用，调控基因的表达。目前关于FATP1基因表达调控研究表明，FATP1主要受过氧化物酶体增生物激活受体（PPARs）、激素（研究较多的是胰岛素）、细胞因子等多种物质调控，与其他调节因子共同调节长链脂肪酸的转运，维持机体稳态［13］。很多研究都指出在小鼠的肝脏和肿瘤细胞中过氧化物增殖酶体及其受体（PPAR）对FATP1起到一个正调控的作用［14，15］。该基因上游区域-474 bp- -458 bp存在功能性过氧化物酶体增生物激活受体（PPARs）反应元件且能被PPARα和PPARγ激活物上调［16］。有关研究表明，胰岛素在脂肪细胞中负向调控FATP1的表达［17，19］。胰岛素对FATP1调控快速、可逆，主要通过定位于-1 353 bp和-1 347 bp的顺式磷酸烯醇丙酮酸羧基酶类似元件［20］，在转录水平上调控成熟脂肪细胞中FATP1基因的表达。因此，研究该基因的转录因子与结合位点间的相互作用是认识转录调控机制的关键所在。

图8 FATP1基因启动子区域系统进化树

本研究利用启动子在线分析软件研究了牛FATP1基因5'侧翼区的各种转录因子结合位点的分布情况，找到了4个转录起始位点和40个转录因子结合位点。一些多次出现且分值较高的转录因子包括AP-2αA、C/EBP-β、C/EBP-α、GR-α、RXR-α和Pax-5等，可能对调节FATP1基因的调控起着至关重要的作用。近年来，有关AP-2α在调控脂肪细胞成熟和脂肪因子分泌的研究表明，AP-2α表达的下调，是启动脂肪细胞分化的重要环节之一。AP-2α可与脂肪细胞分化关键转录激活因子C/EBP-α基因结合，调控C/EBP-α基因转录活性，C/EBP-α基因表达增加显著促进前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化［21］。RXR-α作为配体激活型转录因子，能与PPARγ形成二聚体促进小鼠前脂肪细胞分化［22］。最近研究表明，RXR-α具有促进猪前体脂细胞分化和抑制猪前体脂肪细胞凋亡的作用［23］。而Pax-5对B淋巴细胞的定向分化发育起着重要作用，它通过调节组蛋白的甲基化、乙酰化修饰，调控B淋巴细胞特异性基因表达，从而实现B细胞定向分化发育［24］。所以这些多次出现的转录因子结合位点的区域更有可能是启动子区。同时还有一些单次出现，且分数较高的转录因子结合位点，包括PPAR-α （-360 bp- -349 bp）、NFI/CTF （-190 bp- -182 bp）、NF-kappaB1 （-275 bp- -267 bp）等，它们参与调节基因的复制和表达，对动物的生长调控起着重要作用［25，26］。所以研究基因的转录因子结合位点对于启动子的定位意义重大。

4 结论

牛与人、小鼠、大鼠、狗的FATP1基因5'侧翼区同源性分别为74.1%、71.1%、72.0%、62.8%。并且牛与人、小鼠和大鼠在FATP1基因5'侧翼区的转录起始点上游-263 bp- -174 bp区域保守性较强，同源序列主要集中在转录起始点上游-578 bp- -93 bp区域。在FATP1基因5'侧翼区的转录起始点上游-263 bp- -174 bp区域，牛与人、小鼠、大鼠有共同的转录因子结合位点，在调控基因转录和翻译方面具有共同的作用，所以可能是启动子的核心区域。

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