盐碱地星星草根cDNA文库的构建及初步分析

付畅 王胜楠 郭敏

（哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，哈尔滨 150025）

同甜土植物相比，盐生植物具有较强的耐盐碱能力，其中蕴含着丰富的耐盐碱基因资源，是研究植物耐盐碱分子机制和分离耐盐碱基因的良好材料。星星草（Puccinellia tenuiflora）是禾本科碱矛属单子叶盐生草本植物，耐受NaCl的最高浓度可以达到600 mmol/L，耐受Na2CO3的浓度可以达到200 mmol/L［1］，能在pH9-10以上的盐碱地上生长发育［2］。对星星草耐盐碱性的生理学研究已经获得了较为系统和全面的认识［1-5］。对星星草耐受NaHCO3的转录应答分子机制的研究也取得了重要的进展［6-9］，鉴定了400 mmol/L NaHCO3胁迫条件下星星草基因的表达谱，以及40 g/L （～476 mmol/L）NaHCO3胁迫下星星草的差异表达基因。

根是植物抵御盐碱胁迫的第一道防线，根对盐碱胁迫的敏感程度制约着整个植株的产量［10］。植物感受盐胁迫信号后将其转变成引起根部生长和发育变化的生理过程。盐胁迫下转录因子AP2/EREBP1207和MYB119的表达水平在整个根部中的变化微小，而在根尖中却被强烈诱导［11］。这提示我们，以整株植物为材料分析盐胁迫下的差异表达基因，可能会影响一些根部差异表达基因的检测。因此，根是研究植物盐碱胁迫应答机制的重要位点。

本研究以盐碱地上生长的星星草的根为材料，利用SMART技术构建cDNA文库，旨在为揭示星星草耐盐分子机制、挖掘星星草耐盐基因、培养耐盐植物奠定重要基础。

1 材料与方法

1.1 材料

星星草根采自肇东盐碱地。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取及mRNA的分离 采用改进的SDS法［12］从星星草根中提取总RNA，用无RNA酶的DNA酶Ⅰ去除基因组DNA污染，再用RNAclean RNA清洁纯化试剂盒（原平皓公司产品）纯化总RNA。用Gene Spec V核酸蛋白分析仪测定总RNA的浓度和纯度。用1.2%的琼脂糖凝胶凝胶电泳检测 总RNA的 完 整 性。用PolyATtract®mRNA Isolation Systems（Promega公司产品）从总RNA中分离mRNA。

1.2.2 cDNA文库的构建 以0.5 μg mRNA为模板，按照CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construct ion试剂盒（Clontech公司产品）的说明书操作合成cDNA第一链，然后以其为模板通过LD-PCR（Long-distance PCR）扩增合成双链cDNA。利用Sfi限制性内切酶酶切纯化后的双链cDNA，用CHROMA SPIN-400柱对双链cDNA进行分级分离。将分级分离后的双链cDNA连接到质粒载体pDNR-LIB上。将连接产物以电转化方法（电压1 800 V、电容25 μF、电阻200 Ω、脉冲时间5 ms）转化大肠杆菌感受态细胞JM109。

1.2.3 cDNA文库质量的检测 按照CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construct ion试剂盒（Clontech公司）说明书操作，测定文库的滴度。挑取转化平板上的菌落，以载体引物M13-f和M13-r进行菌落PCR筛选，以确定插入片段的大小和文库的重组率。PCR反 应 体 系 为：1 μL 10×PCR缓 冲 液，0.8 μL dNTP（2.5 mmol/L），M13-f（10 μmol/L）和M13-r（10 μmol/L）各0.1 μL，0.1 μL rTaq （5 U/μL），用无菌牙签在转化平板中蘸取菌落作为模板加入反应混合物，加灭菌的去离子水至10 μL。PCR反应条件为：94℃ 预变性4 min；94℃ 30 s，56℃ 30s，72℃ 30 s，作30个循环；最后72℃ 延伸10 min。

1.2.4 ESTs的序列测定与功能注释 随机从平板上挑取25个阳性重组子进行测序，利用NCBI网站上的VecScreen程序去除载体序列，利用Blastx程序在NCBI Nr数据库中对ESTs序列进行相似性比对。

2 结果

2.1 盐碱地星星草根总RNA的提取与纯化

按照改进的SDS法提取盐碱地星星草根的总RNA。用DNaseⅠ（RNase-free）对总RNA进行消化，去除基因组DNA的污染，再用RNA清洁纯化试剂盒纯化消化后的总RNA。琼脂糖凝胶电泳的检测结果（图1）显示，28S rRNA与18S rRNA条带清晰，且其亮度比例达到2∶1，表明RNA的完整性较好。紫外分光光度法的检测结果显示，OD260/OD280的比值为2.0，表明RNA的纯度较高，可以用于下一步的反转录反应。

图1 盐碱地星星草根总RNA的电泳检测

2.2 双链cDNA的合成

用1%琼脂糖凝胶电泳检测合成的双链cDNA，结果（图2）显示，双链cDNA片段分布在0.5-2 kb之间，表明合成的cDNA双链中具有较多的长片段，达到构建cDNA文库的要求。

图2 双链cDNA 的LD-PCR产物的电泳检测

2.3 cDNA文库滴度的测定

按照CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construct ion试剂盒说明书的操作，经过测定，扩增后文库的滴度为1.747×109CFU/mL，已达到文库构建库容量的要求。

2.4 cDNA文库重组率的计算

从转化平板上随机挑取24个单菌落，以载体引物M13-f和M13-r进行菌落PCR。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的结果（图3）显示，插入片段在0.25-1 kb之间，文库的重组率为92%。

图3 插入片段的检测

2.5 cDNA文库ESTs的序列测定与分析

从转化平板上进一步挑取单菌落，以载体引物M13-f和M13-r进行菌落PCR筛选。随机挑取25个阳性重组子进行测序，利用NCBI网站上的VecScreen程序去除载体序列，共测得20个ESTs序列。通过Blastx程序在NCBI Nr数据库中对20个ESTs序列进行同源性比对的结果（表1）表明，有8条序列没有在数据库中找到相似的序列，9条序列与数据库中的序列相似性较低，3条序列与数据库中的相似性较高。

表1 盐碱地星星草根cDNA文库基因的Blastx分析结果

3 讨论

3.1 盐碱地星星草根cDNA文库的构建策略与文库质量评价

本研究采用CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construction Kit构建了盐碱地星星草根的cDNA文库。采用LD-PCR技术扩增双链cDNA的第二条链，可富集文库中的低丰度以及稀有基因，提高文库的代表性；利用CHROMA SPIN-400柱对cDNA进行分级分离，可有效除去小片段的cDNA，可富集低丰度的mRNA在文库中出现的频率，一方面保证了文库的有效滴度；另一方面提高文库的代表性。扩增后文库的滴度为1.747×109CFU/mL；插入的最大片段为1 kb，插入的片段主要集中在0.75 kb左右；文库的重组率为92%。文库的质量符合构建cDNA文库的要求。

3.2 cDNA文库ESTs序列的初步分析

编号为CYJDR3-17的EST序列与一粒小麦（Triticum monococcum）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、玉米（Zea mays）、大麦（Hordeum vulgare subsp. Vulgare）和茶树（Camellia sinensis）等众多物种的S-腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosylmethionine synthetase，SAMS）基因的氨基酸序列具有较高的相似性，其中与一粒小麦、二穗短柄草和大麦的相似性达到100%。SAMS基因编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶，该酶可催化甲硫氨酸与ATP生成S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）。SAM在生物的生命活动中发挥重要作用，不仅是激素、核酸、蛋白质、磷脂等物质合成的甲基供体，还是多胺及乙烯合成的前体物质［13］。SAMS在植物逆境生理、衰老生理、植物生物代谢中发挥重要作用［14］。SAMS基因能被外源乙烯、盐胁迫、渗透胁迫、氧化胁迫、高温胁迫、低温胁迫、镉胁迫诱导表达［13，14］，广泛参与多种逆境胁迫应答反应。

SAMS基因在植物的盐胁迫应答中发挥重要作用。盐胁迫下，SAM参与植物激素、核酸、蛋白质和磷脂等物质的合成；通过影响多胺和乙烯的含量调节植株的耐盐性；参与植株木质化的形成，通过质外体途径调节水分运输和离子吸收［13］。盐胁迫可诱导SAMS基因的表达，盐胁迫下黄瓜SAMS基因的表达呈现出先升高后降低的趋势［13］。野生大豆SAMS基因在烟草中的超量表达提高了转基因烟草植株的耐盐性［14］。SAMS基因是一个重要的耐盐相关基因，我们从盐碱地星星草根的cDNA文库中筛选到的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因2的EST片段，在本研究工作的基础上可进一步通过RACE技术克隆星星草SAMS2基因的全长cDNA以及ORF，并鉴定其功能。星星草SAMS2基因的克隆与功能鉴定有助于理解植物逆境胁迫应答反应，可为该基因的利用提供理论依据。SAMS2基因可以作为植物耐盐基因工程的候选工具基因，有望用于培育耐盐性较强的植物品种，改良和利用盐碱地。

编号为CYJDR3-17的EST序列与玉米钙牵蛋白基因的氨基酸序列具有较高相似性，达到90%。钙牵蛋白也被称为中心体蛋白，是真核生物基本/中心体复合物的普遍组成成分，是与钙调素结构类似的钙调EF-hand蛋白。Ko等［15］从1.7 mol/L NaCl条件下生长的杜氏盐藻（Dunaliella salina）的cDNA文库中分离了钙牵蛋白基因DsCALT。这些信息表明，钙牵蛋白与耐盐性密切相关。目前关于植物钙牵蛋白基因的研究较少，深入研究植物钙牵蛋白基因的功能，将有助于理解植物的耐盐分子机制。

4 结论

利用SMART技术构建了盐碱地星星草根的cDNA文库。扩增后文库滴度为1.747×109CFU/mL；插入的最大片段为1 kb，插入的片段主要集中在0.75 kb左右；文库的重组率为92%。文库的质量满足构建cDNA文库的要求。从该文库中筛选到耐盐相关基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶2基因和钙牵蛋白基因的EST片段，表明该文库可用于进一步从中筛选星星草耐盐基因。

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