HBV 复制及其基因分型与HBV 相关慢性肝病关系的临床研究＊

江必武， 叶丽华， 王 平△

1武汉市第一医院消化内科，武汉 430022

2华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科，武汉 430030

乙型肝炎在全球广泛分布，在我国显得更为突出，据统计在我国50%肝硬化和70%～90%肝癌由慢性HBV 感染引起，这与HBV 具有病毒复制产量高（1012～1013病毒粒／d）和突变率高（1010～1011点突变／d）等特征有关。长期点突变累积形成了不同的基因型，迄今为止，HBV 基因型可以分为8个型，即A、B、C、D、E、F、G 和H 型［1－2］。在众多影响HBV 感染后转归的因素中，HBV 基因型及基因突变起着重要作用。虽然HBV 基因型能在一定程度上解释乙型肝炎的病情程度、预后和转归，但我们也发现，相同基因型的HBV 可引起不同的临床表现。近年来我们分析了500 例慢性HBV 感染者的HBV 基因型，旨在探讨HBV 基因型与相关慢性肝病的相互关系及临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

500例慢性HBV 感染者来自2009～2011年武汉市中西医结合医院门诊及住院患者，男性284例，年龄（46.7±15.7）岁；女性216 例，年龄（46.0±15.5）岁。慢性乙型病毒性肝炎262 例，其中轻度122例、中度125例、重度15例；乙型肝炎后肝硬化206例，其中代偿期56例、失代偿期150例（腹腔积液85例，脾亢102例，食管胃底静脉曲张48例）；原发性肝细胞癌32例。诊断均符合卫生部行业学会颁布的2000年《病毒性肝炎防治方案》及2010年《慢性乙型肝炎防治指南》，并排除混合感染其它类型病毒性肝炎。肝癌患者乙型肝炎表面抗原阳性，临床诊断为肝细胞癌。采集静脉血10mL，留取血清标本保存于－80℃冰箱备用，进行血常规、肝功能、乙肝标记物、HBV－DNA定量及基因分型等检测。

1.2 试剂和仪器

PCR 酶体系购自Clontech 公司。dNTP 购自上海生工生物技术公司。PCR 产物回收试剂盒购自美国OMEGA 公司。DL2000 分子量标记物购自北京天根生物科技公司，琼脂粉为日本进口分装，ABI公司的9700 型PCR 热循环仪。大型高速离心机为美国SORVALL 公司的RC6。将HBV 全基因组分为有重叠的S、SX、CX、SC 4 个区段设计引物，引物设计方法参照文献［3］，送上海Invitrogen公司合成。

1.3 HBV－DNA基因型检测

基因型检测采用第一军医大学基础生物医学诊断研究中心提供的HBV 基因分型PCR 微板核酸杂交－ELISA 试剂盒，检测方法按说明书进行。

1.4 检测指标

肝功能、乙肝标记物、HBV DNA 定量（copies／mL）检测。肝功能检测采用全自动生化分析仪检测白蛋白、球蛋白、总胆红素（TBIL）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天门冬氨酸转氨酶（AST）等；检测HBsAg、抗－HBs、HBeAg、抗－HBe、抗－HBc 等采用ELISA 法，试剂由上海科华生物技术有限公司提供；HBV DNA 采用免疫荧光定量PCR 检测，试剂购自中山大学达安基因股份有限公司，试剂盒检测下限5×102copies／mL。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件处理数据。计量资料组间均数比较采用t检验，计数资料组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乙肝标记物、HBV－DNA在相关肝病中的分布情况

500例患者中乙肝标记物HBeAg总的阳性率为50.2%（251／500），其中在轻度慢性肝炎中占49.2%（60／122），在中度慢性肝炎中占54.4%（68／125），在重度慢性肝炎中占73.3%（11／15）；HBeAb总的阳性率为48.2%（241／500）；HBV－DNA 总的阳性率为28%（140／500），其中在中度慢性肝炎中占40%，在重度慢性肝炎中占60%。见表1。

表1 乙肝标记物、HBV－DNA 分布情况Table 1 Distribution of HBV markers and HBV－DNA

2.2 HBV－DNA基因分型

在500例慢性HBV 感染者中检测出140 例HBV－DNA 阳性，其HBV－DNA 基因型分布：B 型66例（47.1%），C 型74 例（52.9%），没有发现A、D、E、F、G 和H 型。各种肝炎病变组的基因型构成差异有统计学意义，B 基因型在慢性肝炎（中度、重度）所占百分比高于B 型差异有统计学意义（χ2＝4.45，P＜0.01）；C 型在肝硬化中所占的百分比显著高于B 型（χ2＝11.06，P＜0.01）；而在肝细胞癌中B 型和C 型所占百分比差异无统计学意义。见表2。

2.3 基因型与肝功能受损的关系

140例感染基因B、C型的患者在丙氨酸氨基转移酶（ALT）、γ－谷氨酰转移酶（γ－GT）、总胆红素（TBIL）和HBV－DNA 含量差异均无统计学意义，而白蛋白（ALB）的改变在B、C 型中差异有统计学意义（t＝3.07，P＜0.05）。见表3。

表3 基因型与肝功能的关系（±s）Table 3 The relationship between genotype and liver function（±s）

表3 基因型与肝功能的关系（±s）Table 3 The relationship between genotype and liver function（±s）

t＝3.07，＊P＜0.05

基因型例数ALT（U／L）TBIL（μmol／L）γ－GT（U／L）ALB（g／L）HBV－DNA（copies／mL）B型66 163.0±48.4 64.3±37.8 110.0±54.2 37.2±12.4 5.08±1.12 C型74 159.0±47.8 62.5±38.3 112.0±56.3 28.5±8.6＊5.22±1.23

3 讨论

自1998年Okamoto等［4］通过对18 株不同血清型的HBV 全基因组序列进行比较后发现，同一血清型HBV 的基因序列并不相同。由此拉开了学者们对乙型肝炎病毒基因型及其亚型深入研究的序幕。根据全基因组序列的差异≥8%，或S基因组序列的差异≥4%，将HBV 株分为A～H 8 种基因型。近年来，国内外学者对HBV 流行病学进行了大量的研究，目前已基本明确，HBV 存在地理性分布差异。我国以B和C基因型为主，南方以B型为主，北方以C型为主。本研究采用PCR 微板核酸杂交－ELISA 法检测本地区140例HBV－DNA 阳性患者的基因型，结果显示C基因型74例，占52.9%，B基因型66例，占47.1%，提示本地区HBV 感染者基因型以C型稍占优势。

HBV 感染后的临床转归受多种因素的影响，HBV 基因型可能是其中重要因素之一。本研究对500例HBV 相关慢性肝病患者同时进行乙肝标记物、HBV－DNA 检测，结果显示：HBeAg 阳性率为50.2%（251／500）；HBeAb 阳性率为48.2%（241／500）；HBV－DNA 阳性率为28%（140／500）。有文献报道HBV 基因型与病毒复制水平及病毒标志物的表达有一定的相关性，提示基因型B 的HBeAg血清转换率比基因型C 要高，基因型C 较基因型B有较高的HBeAg 阳性率［5］。目前认为，不同地区的优势基因型反映了HBV 自然感染史发生的变异特点，是病毒变异后进化的结果。研究显示B 基因型与较轻的病变有关，C 基因型与较重的病变有关［6］。本组资料研究结果亦显示，B、C 基因型在慢性肝炎（轻度）、肝硬化（代偿期）与HBV－DNA 水平及肝功能间差异无统计学意义，但肝组织学改变、血清白蛋白与基因型显著相关，在慢性肝炎（中、重度）中B基因型显著高于C基因型，差异具有统计学意义；而在肝硬化（失代偿期）C 基因型显著高于B 基因型，差异具有统计学意义。

随着分子生物学技术的不断进展，对HBV 基因型的研究也将越来越深入，HBV 基因型及其亚型的研究丰富了HBV 分子流行病学内容，对HBV 相关肝细胞癌（HCC）的临床诊断、疗效判断、预后分析等均具有重要的指导意义。通过本研究了解到湖北地区HBV－DNA 基因型分布以B、C两型为主，为我们以后就B、C基因型及亚型做进一步深入研究、重点了解其与慢性肝炎、肝硬化、原发性肝癌的关系及其作用机制打下基础，从而为我国，特别是为湖北地区原发性肝癌的一级预防和二级预防提供了重要实验和理论依据，为提出切实有效的综合防治措施以降低原发性肝癌发生率具有重要意义。

［1］ Norder H，Hammas B，Löfdahl S，et al.Comparison of the amino acid sequences of nine different serotypes of hepatitis B surface antigen and genomic classification of the corresponding hepatitis B virus strains［J］.J Gen Virol，1992，73（Pt 5）：1201－1208.

［2］ Stuyver L，De Gendt S，Van Geyt C，et al.A new genotype of hepatitis B virus：complete genome and phylogenetic relatedness［J］.J Gen Virol，2000，81（Pt 1）：67－74.

［3］ Takahashi K，Akahane Y，Hino K，et al.Hepatitis B virus genomic sequence in the circulation of hepatocellular carcinoma patients：comparative analysis of 40full length isolates［J］.Arch Virol，1998，143（12）：2313－2326.

［4］ Okamoto H，Tsuda F，Sakugawa H，et al.Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence：comparison of surface subtype［J］.J Gen Virol，1988，69（Pt 10）：2575－2583.

［5］ Watanabe K，Takahashi T，Takahashi S，et al.Comparative study of genotype B and C hepatitis B virus－induced chronic hepatitis in relation to the basic core promoter and precore mutations［J］.J Gastroenterol Hepatol，2005，20（3）：441－449.

［6］ 黄晶，高志良.乙型肝炎病毒基因型及其临床意义的研究［J］.世界华人消化杂志，2002，10（11）：1362－1364.