AAV2介导ND4基因治疗LHON 不同免疫抑制方案的比较研究＊

高 晶， 石 慧， 裴 晗， 万 幸， 胡维琨， 李 涛， 杜 皓， 李 斌

华中科技大学同济医学院附属同济医院眼科，武汉 430030

Leber 遗传性视神经病变（Leber hereditary optic neuropathy，LHON）是一种严重危害人类视力的遗传性疾病，常累及黄斑乳头束纤维，表现为视网膜节细胞死亡。临床主要症状为双眼同时或先后发生的急性或亚急性无痛性视力减退，主要是由线粒体DNA 突变引起，其中G11778A 核苷酸位点是最常见的发病位点［1］，60%病例为该位点突变，此突变使呼吸链上NADH 脱氢酶亚单位4（NADH dehydrogenase subunit 4，ND4）基因编码的氨基酸发生改变，当前尚无有效的治疗方法。

2007年英国和美国的两个研究小组分别利用腺相关病毒血清型2（adenovirus associated virus 2，AAV2）载体携带RPF65基因转染到人的眼内治疗LHON，结果显示基因替代治疗改善了患者的视力［2－3］，使我们看到了基因治疗遗传性疾病的希望。ND4基因突变在LHON 患者中占半数以上，因此转染ND4基因被认为是治疗LHON 更有效的方案。目前AAV2病毒重组基因治疗遗传性眼内疾病有两种方法：玻璃体腔注射和视网膜下注射。现有的研究证实，视网膜下注射起效时间较慢（2～4周内），且转染的细胞主要是视网膜色素上皮细胞和部分感光细胞，而玻璃体腔注射1周后视网膜节细胞转染效率可达90%以上，可有效挽救LHON 患者急性期急剧下降的视力［4］。但视网膜下注射存在一定程度的免疫赦免效应，但玻璃体腔注射能诱发机体的免疫反应［5－8］，出现相应的中和抗体，将影响AAV2介导的ND4基因转染表达效率。因此如何减轻AAV2所引起的免疫反应是AAV2在临床应用的关键所在。

基于上述观点，本研究设计了不同的免疫抑制方案：以强的松为代表的糖皮质激素在临床应用最为广泛，它能抑制吞噬细胞处理抗原及抑制B 细胞分化、减少抗体产生，常常是用来抑制免疫反应的首选药物。曲安奈德是一种长效的糖皮质激素，临床上玻璃体腔注射曲安奈德已被公认是一种成熟有效的免疫抑制治疗方案。环孢霉素A 是一种新型强效的免疫抑制剂，它能选择性抑制辅助性T 细胞B细胞，促进抑制性T 细胞，从而抑制机体的免疫反应。这些药物被公认在治疗眼科免疫性疾病有成熟的治疗方案和明确的临床效果。我们选择上述药物用动物实验观察ND4的表达效率及全身免疫反应的强弱，为将来的临床治疗选择一种最优的方案。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

健康雄性SD 大鼠20只（同济医学院实验动物学部提供），体重150～180g；AAV2－ND4（本实验室提供［9－10］）；环孢霉素A（瑞士诺华公司）；强的松片（天津力生制药股份有限公司）；曲安奈德（昆明积大制药有限公司）；0.01mol／L 磷酸缓冲盐溶液（美国Sigma公司）；水合氯醛、多聚甲醛、蔗糖（国药集团化学试剂有限公司）；盐酸奥布卡因滴眼液（参天制药株式会社）；ELISA 试剂盒（美国R＆D 公司）；抗ND4单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；绿色荧光蛋白多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；OCT 包埋剂（美国Sakura Finetek公司）。

1.2 玻璃体腔注射重组体腺相关病毒

SD 大鼠腹腔注射10%水合氯醛至安静后，右眼局部予盐酸奥布卡因滴眼液表面麻醉。在距角膜缘外3mm 处穿刺睫状体平坦部进入玻璃体腔内。实验分为5组，每组4 只大鼠，A 组为未免疫抑制组，B组为环孢霉素A 组，C 组为强的松组，D 组为强的松＋曲安奈德组，E 组为对照组。A、B、C 组每只大鼠注射4μL AAV2－ND4［病毒含量为8.8×108vg（vg＝vector genome）］，D 组每只大鼠注射4 μL AAV2－ND4＋曲安奈德（1∶1等体积混合，其中病毒含量为8.8×108vg，曲安奈德160μg），对照组E组注射4μL 0.01mol／L 磷酸缓冲盐溶液，术后红霉素眼膏敷眼。

1.3 术后全身用药

B、C、D 组从玻璃体腔注射术后第1 天开始全身给药，采用灌胃的方式给予药物，连续4周。B组给予环孢霉素A，起始剂量10mg／（kg·d），2周后减量为5mg／（kg·d）。C、D 组给予强的松片，起始剂量5 mg／（kg·d），2 周后减量为2.5 mg／（kg·d）。

1.4 酶联免疫吸附实验检测（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）

用于检测实验动物血清中对大鼠AAV2衣壳蛋白和ND4基因的抗体含量。ELISA 试剂盒采用双夹心酶联免疫吸附法。在预先包被AAV2 或ND4基因单克隆抗体酶标孔加入相应标准品和稀释后的样品血清，加入HRP 标记过的相应酶标试剂，37℃温育30min，之后加入TMP和H2O2显色底物，H3PO4终止显色反应，酶标仪在450nm 波长处测量各孔的吸光度（A）值。根据标准品的浓度及对应的A 值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的A 值和直线回归方程计算出对应的样品浓度。测出的每孔浓度乘以血清的稀释倍数即得到待测样品浓度。分别于玻璃体腔注射术后3d、7d、4周、8周、12周取各组大鼠尾静脉血液标本，进行ELISA 检测。

1.5 视网膜切片及免疫荧光检测

在玻璃体腔注射AAV2－ND4 12周后，过量麻醉处死大鼠，立即摘除双侧眼球浸泡于4%多聚甲醛中。1h后移除角膜和晶体组织，制成眼球后段眼杯。浸泡于30%蔗糖过夜，取出予以OCT 包埋剂包被。冰冻切片机切片，视网膜切片厚度10μm。0.01mol／L PBS漂洗切片，一抗（抗ND4）4℃孵育过夜，二抗（绿色荧光蛋白）37℃孵育1h，激光共聚焦显微镜（德国Leica公司，Leica TCS－SP5）观察荧光。

1.6 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析。实验检测的数据资料均以±s表示，对玻璃体腔注射后不同时间点时ELISA 所检测的各组数据选用单因素多水平设计定量资料方差分析。组间样本均数与对照组的比较采用Dunnett－t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 视网膜切片免疫荧光检测

实验组（A～D 组）与对照组（E 组）比较，视网膜切片视神经节细胞层（retinal ganglion cells layer，RGCs）明显有ND4阳性表达，而在视网膜其它各层无明显特异性表达。见图1。

图1 视网膜节细胞层免疫荧光染色示ND4蛋白表达（共聚焦显微镜，×200）Fig.1 Immunofluorescence staining of ND4in retinal ganglion cell layer（laser confocal microscope，×200）

2.2 ELISA检测各组大鼠血清中抗ND4基因抗体浓度

各组血清抗ND4基因抗体浓度－时间折线图见图2。比较在玻璃体腔注射后第3、7天及28天时，各组抗体浓度差异无统计学意义（表1）。而在第56天时A～D 各组抗体浓度均显著增加，其中A、C 组增加幅度较B、D 组大。第84天时A～C 组抗体浓度出现不同程度下降，D 组则小幅度增加，而在此时间点下，B～D 组抗体浓度与A 组间无统计学差异，但均明显高于对照组E（表1）。

2.3 ELISA检测各组大鼠血清中抗AAV2抗体浓度

各组血清抗AAV2抗体浓度－时间折线图见图3。玻璃体腔注射后第3天时，各组抗体浓度差异无统计学意义（表2）。而在第7天，A～D 组抗体浓度出现不同程度下降，但在此时间点下组间比较无统计学差异。当第28天时，A～D 组抗体浓度均明显增加，其中A、C 组抗体浓度高于B、D 组。到第56天时，除B 组外各组抗体浓度均出现下降，特别是A、D 组抗体浓度与对照组E间差异无统计学意义，而B、C组抗体浓度仍高于对照组E（表2）。

图2 血清抗ND4基因抗体浓度时间折线图Fig.2 The concentration－time relationship of the serum antibody against ND4after intravitreal injection

图3 血清抗AAV2抗体浓度时间折线图Fig.3 The concentration－time relationship of the serum antibody against AAV2after intravitreal injection

表1 各组血清抗ND4基因抗体浓度的比较（±s，n＝4，ng／L）Table 1 Comparison of the concentration of serum antibody against ND4among groups（±s，n＝4，ng／L）

表1 各组血清抗ND4基因抗体浓度的比较（±s，n＝4，ng／L）Table 1 Comparison of the concentration of serum antibody against ND4among groups（±s，n＝4，ng／L）

与A 组比较，＊P＜0.05；与E组比较，rP＜0.05

Group s 3d7d28d56d84d A 90.120±10.573 100.525±2.543 110.170±8.599 180.969±5.576r130.240±27.930 r B 89.952±3.316 103.725±15.464 100.751±8.137 145.095±0.075＊r142.819±0.120r C 90.658±4.280 107.849±6.106 104.797±10.632 185.657±16.230r150.025±18.057r D 79.546±4.017 101.453±11.329 99.341±2.252 151.542±0.233＊r158.497±0.371r E 96.618±12.093 93.114±6.577 110.383±20.554 117.754±4.985 90.406±6.021 F 0.625 0.320 0.195 30.646 3.849 P＞0.05＞0.05＞0.05＜0.01＜0.05

表2 各组血清AAV2抗体浓度的比较（±s，n＝4，pg／L）Table 2 Comparison of the concentration of the serum antibody against AAV2among groups（±s，n＝4，pg／L）

表2 各组血清AAV2抗体浓度的比较（±s，n＝4，pg／L）Table 2 Comparison of the concentration of the serum antibody against AAV2among groups（±s，n＝4，pg／L）

与A 组比较，＊P＜0.05；与E组比较，rP＜0.05

s 3d7d28d56d Group A 65.439±10.158 35.561±5.134 137.504±43.835r 90.624±5.632 B 79.057±16.179 59.412±5.292 98.359±7.107＊105.978±12.712r C 78.017±9.660 58.191±11.248 133.401±20.915r112.400±8.183＊r D 66.795±0.901 36.249±7.976 112.995±7.808＊r79.454±0.865 E 71.577±16.112 68.226±20.580 95.631±7.259 80.978±5.265 F 0.272 1.635 24.789 8.060 P＞0.05＞0.05＜0.01＜0.01

3 讨论

目前LHON 在临床上没有有效的治疗方法。随着基因工程技术的日益发展，基因治疗有可能成为治疗LHON 的新希望。玻璃体腔内注射AAV2－ND4重组体基因被认为是一种有效的导入方式［11－12］，其ND4基因表达的有效性在国外研究组和我们的前期研究中已得到证实［13］。而玻璃体腔内注射能引起机体发生免疫反应，这对ND4基因表达的安全性是一定挑战。为此，我们研究组设计了上述实验，观察3个月内其体内相应抗体浓度变化和ND4基因表达，以了解相关免疫反应的变化特点和选择合适的免疫抑制药物，为将来基因治疗安全应用于临床提供参考。

我们的实验结果显示：在注射后84d，各免疫抑制组RGCs 层仍可见到ND4 表达。这说明了AAV2病毒介导ND4基因能转染RGCs并长效表达，未明显受到全身抗体免疫反应的影响。各实验组血清ND4基因抗体浓度在注射后56d时抗体浓度增加显著，达到或接近峰值（图2），初步说明其免疫反应的危险期主要集中在注射后56d内。而各实验组抗AAV2抗体浓度则在注射后28d时明显升高，除B组外56d时浓度轻度下降。这与有些研究者认为的2个月时抗体浓度才达到最大值的研究有所不同。我们分析，这一结果可能与注射方式有关，Li等［14］采用的是多次玻璃体腔注射，而我们采用的是单次玻璃体腔注射AAV2－ND4，且注射的病毒量少于对方，可能初次预敏不足以刺激产生大量的抗体，机体难以长期持续高抗体水平。这一结果也提示，减小玻璃体腔注射剂量能够减轻免疫反应。

另外，通过比较各组间实验结果，我们认为，无论是糖皮质激素还是环孢素A，都未能达到抑制AAV2－ND4相应免疫反应的理想效果。口服强的松组（C组）免疫抑制效果相对最弱，与未免疫抑制组（A 组）比较差异不明显。而环孢素A（B组）和曲安奈德玻璃体腔注射＋术后口服强的松片（D 组）虽可在免疫反应高峰期间发挥一定的免疫抑制作用，但观察其高峰期后效果却有限。然而上述方法存在较多并发症，如环孢霉素A 全身毒副作用较大，损害肾功能，加重机体负担；而曲安奈德的注射会引起高眼压症状，加速白内障发展。这些问题都会阻碍它们在临床基因治疗中的应用。权衡利弊，这几种方法都并非最佳选择。

因此在未来的临床治疗中，可以考虑通过3个途径解决这一问题，治疗前对患者进行检测，选择AAV2抗体阴性患者进行基因治疗，而AAV2抗体与CD8密切相关［15－16］，同时检测患者CD8的值，正常者方可接受基因治疗；在治疗中，我们此前研究及本实验确定AAV2－ND4的注射剂量为2×1011vg／mL，如果能进一步减小剂量，可降低免疫反应的程度；在治疗后，检测患者免疫反应半年甚至更长时间，特别是前3个月，需密切监测体内抗体水平。

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