土木香和冷蒿中倍半萜内酯化合物抑制人乳腺癌细胞增殖活性及构－效关系研究

李 明，刘 霞，郭书翰，董 玫，杜正伦，高鹏志，宋铁鹰* ，史清文*

1石家庄市第一医院，石家庄050011;2 河北医科大学基础医学院法医学系，河北省法医学重点实验室，石家庄050017

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，且发病率高，居女性恶性肿瘤的首位［1］。目前临床上乳腺癌抗癌药物的选择性差，不良反应大，使得化疗药物的使用受到一定的限制，且肿瘤转移是引起癌症患者死亡的主要原因。因此寻找疗效确切，作用机理清楚，治愈率高，毒副作用小的抗癌药物，攻克癌症成为全世界医药工作者亟待解决的一大课题。

土木香(Inula helenium )其根供药用，具有健胃、利尿、祛痰和驱虫等功效［2］。冷蒿(Artemisia frigida )全草入药，在中药和蒙药上都有应用，在中药上主要治疗黄疸型肝炎，胆囊炎，小便不利，皮肤瘙痒，湿疹，蛔虫病和蛲虫病，其蒙药主治吐血，鼻出血，月经不调，外伤出血，疮疡，肾热等［3］。药理活性研究发现倍半萜内酯类成分有抗肿瘤细胞增殖作用、抗炎、抗真菌和抗结核分支杆菌等作用等多样的生物活性［4］。本文首次报道从土木香和冷蒿中纯化的八种倍半萜内酯化合物的体外抑制人乳腺癌细胞增殖活性，并探讨了这八种倍半萜内酯化合物结构与活性之间的关系。

1 材料与方法

1.1 受试物

8 种倍半萜内酯化合物:2-羟基-11，13-二氢异土木香内酯(1)、11，13-二氢异土木香内酯(2)、异土木香内酯(3)、去氢-α-姜黄烯(4)、11，13-二氢愈创内酯C(5)、二氢去氢木香内酯(6)、11，13-二氢愈创内酯D(7)和7α-羟基-11βH-11，13-二氢去氢木香内酯(8)由史清文教授从菊科植物土木香和冷蒿中分离得到，均为白色针晶，经核磁共振光谱和质谱确定它们的结构如图1 所示，纯度为99%。

1.2 药品和试剂

噻唑蓝(MTT，Sigma，M-2128);RPMI 1640 培养基(GIBCO);胰蛋白酶(GIBCO);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);顺铂(Sigma，034k3693)。

1.3 细胞系和培养条件

试验用人乳腺癌细胞(MCF-7)和人乳腺癌脑转移细胞(KT)由日本千叶大学医学部第二生物化学教室提供。各肿瘤细胞株接种于直径为100 mm 的培养皿中，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基，37 ℃和5% CO2培养箱中培养。

1.4 实验方法

参照文献［5］中的方法。将处于对数生长期的MCF-7 细胞和KT 细胞悬浮接种于96 孔板，每孔50 μL(含1 ×104个细胞)，再分别加入磷酸盐缓冲液(PBS)、溶剂对照(终浓度0.1% DMSO)、阳性对照顺铂和终浓度为100、10 和1 μmol/L 的化合物1～8各50 μL，每组均设3 复孔，置于饱和湿度、37 ℃和5% CO2培养箱中培养48 h。于培养结束前4 h，各培养孔加入5 mg/mL 四氮唑盐(MTT)10 μL，用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值(OD 值)，测定波长λ=570 nm，参考波长λ=630 nm，并计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率(%)= (1-对照组OD值/实验组OD 值)×100%。受试化合物对细胞的浓度-效应曲线用Hill 数学模型拟合，计算受试化合物的IC50值。实验独立重复3 次。

图1 八种倍半萜内酯化合物的化学结构ig.1 Chemical structures of eight sesquiterpene lactone compounds

1.5 统计学处理

2 实验结果

2.1 化合物1～8 对体外培养的人乳腺癌细胞增殖的抑制作用

结果如图2 所示，100 μmol/L 的异土木香内酯(3)及去氢-α-姜黄烯(4)显示与阳性对照顺铂相同的抑制肿瘤细胞增殖的活性，对MCF-7 细胞生存率分别为34.73%、25.53%、和15.91%，对KT 细胞生存率分别为21.48%、23.38%、25.53%，与空白对照组比均有显著性差异(P ＜0.01);其他的六种倍半萜内酯对两种人乳腺癌细胞的增殖显示较弱的抑制活性。

2.2 化合物3 和4 对MCF-7 细胞增殖活性的作用

化合物4 与阳性对照顺铂对MCF-7 细胞的增殖几乎显示相同的抑制活性，IC50分别为26. 15 μmol/L 和15.04 μmol/L，化合物3 对MCF-7 细胞的增殖抑制活性强于阳性对照顺铂，IC50仅为4.52 μmol/L。化合物3 和4 对MCF-7 细胞的增殖抑制活性呈现浓度梯度依赖性(图3 和表1)。

2.3 化合物3 和4 对KT 细胞增殖的抑制作用

结果如图4 和表1 所示，化合物3 和4 与阳性对照顺铂对KT 细胞的增殖几乎显示相同的抑制活性，化合物3 和4 对KT 细胞的IC50分别为10.10 μmol/L 和18.72 μmol/L，化合物3 和4 对KT 细胞的增殖抑制活性呈现浓度梯度依赖性。

图2 倍半萜内酯化合物对人乳腺癌细胞增殖活性的影响Fig.2 The effect of sesquiterpene lactone compounds on the proliferation of breast tumor cells

表1 异土木香内酯和去氢-α-姜黄烯对人乳腺癌细胞增殖的影响Table 1 The effect of isoalantolactone and dehydrocostuslactone on the proliferation of breast tumor cells

3 讨论

近年来，我国乳腺癌的发病率呈迅速上升趋势，成为威胁女性健康的首要杀手。由于乳腺癌的原因尚不明确，因而早期的诊断和治疗是其防治的有效手段。原位乳腺癌可以通过手术切除，结合放化疗等手段治愈，但是，乳腺癌易于发生远端转移，一但乳腺癌发生转移，进入血液、淋巴、骨骼和脑等器官，增加了临床治疗的困难，也成为晚期乳腺癌难以治愈的主要原因。

植物在其漫长的进化过程中合成了许许多多结构各异的次生代谢天然产物，这些次生代谢产物具有不同的生物活性。近年来，从自然界中寻找发现高效低毒的抗癌活性成分或先导化合物已经成为国内外药物学家十分关注的课题和研究的热点［6-8］。土木香和冷蒿均为菊科植物，含有的倍半萜内酯化合物具有抗肿瘤、抗炎和抗真菌等多样的生物活性［9，10］。

本研究对从土木香和冷蒿中纯化的八种倍半萜内酯化合物进行了体外抑制人乳腺癌细胞增殖活性实验。本实验研究结果显示，从菊科植物土木香和冷蒿中提取纯化的八种倍半萜内酯类化合物中，异土木香内酯和去氢-α-姜黄烯不仅对人乳腺癌细胞的增殖均有明显的抑制作用，对乳腺癌脑转移细胞的增殖均也显示较强的抑制作用，为乳腺癌转移的治疗提供了一个新的研究基础。异土木香内酯和去氢-α-姜黄烯虽然属于不同的结构类型，都具有，不饱和五员内酯环，而其他的六种倍半萜内酯化合物五元内酯环的环外双键饱和后，对乳腺癌细胞和乳腺癌脑转移细胞的增殖活性显著降低或消失，根据实验结果推测:倍半萜内酯化合物抑制人肿瘤细胞增殖活性与其直型和角型结构无关，α，β 不饱和五员内酯是抑制肿瘤细胞增殖活性的必需基团。

随着菊科植物中特有的倍半萜内酯化合物对肿瘤细胞增殖抑制作用的研究的不断深入，为倍半萜内酯化合物的应用开拓了新的前景，为开发具有临床应用价值的天然低毒的化疗药物提供实验依据。

1 Zhou FZ(周放震)，Zhang XY(张晓云)，Sun FY(孙奋勇)，et al. Dihydromyricetin vitro antiproliferative effect on human breast cancer MDA-MB-231cells. Cancer Res Prevent Treat(肿瘤防治与研究)，2012，39:95-97.

2 Delectis Florae Republicae Popularis Sinicae Agendae Academiae Sinicae.Flora Republicae Popularis Sinicae.Beijing:Science Press，1979，75:248-254.

3 Editorial Broad of Flora Republicae Popularis Sinicae，Chinese Academy of Sciences.Flora Republicae Popularis Sinicae，1985，76(2):13-15。

4 Cantrell CL，Abate L，Fronczek FR，et al. Antimycobacterial eudesmanolides from Inula helenium and Rudbeckia subtomentosa.Planta Med，1999，65:351-355.

5 Dong M，Chen SP，Kita K，et al.Anti-proliferative and apoptosis-inducible activity of Sarcodonin G from Sarcodon scabrosus in HeLa cells.Int J Oncol，2009，34:201-207.

6 Galm U，Shen B. Natural product drug discovery:the times have never been better.Chem Biol，2007，14:1098-1104.

7 Ganesan A.The impact of natural products upon modern drug discovery.Curr Opin Chem Biol，2008，12:306-317.

8 Rishton GM. Natural products as a robust source of new drugs and drug leads:past successes and present day issues.Am J Cardiol，2008，101(10A):43-49.

9 Chen JJ(陈进军)，Wang SM(王思明)，Li CF(李存芳)，et al.Studies of sesquiterpenoids from Artemisia frigida on the anti-growth activity of human tumor cell lines. Chin J Herb Pharm，2011，22:440-443.

10 Li Y(李勇)，Li TK(李铁库)，Wen SW(温世旺)，et al.In vivo and in vitro anti-tumor activity studies of five sesquiterpenoids from Inula helenium.Chin Pharm Bull(中国药理学通报)，2010，26:112-115.