穿心莲体内血清指纹图谱建立

王学志，李文兰，2* ，白 晶，2，郎 朗，2

1 哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心;2国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨150076

中药穿心莲(Andrographis)系爵床科穿心莲属植物，具有清热抗炎、抗感染、抗心血管疾病、抗生育、抗氧化、抑制肿瘤细胞生长等多种药理作用［1-5］。研究结果表明:穿心莲对雄性大鼠精子的形成有显著影响，雌鼠不易受孕［6，7］，具有一定的生殖毒性。为从体内过程追踪其药效物质基础，分析口服给药后能进入血液的成分，寻找成分间的相互作用规律，本实验优化血清样品的处理方法，以期减少血清中内源性物质的干扰，获取更多的入血成分信息，并在此基础上在确定最佳的取血时间和血清处理方法，为下一步体内入血成分的分析提供依据。

1 仪器与材料

Waters 高效液相(HPLC)系统(W2695 泵、W2996DAD 检测器、自动进样器、Empower 化学工作站);恒温水浴(DK80，上海一恒科技有限公司);分析天平(ALC-110.4，上海人和科学仪器有限公司);台式低温离心机(Avanti 30，美国BECKMAN);电热恒温水浴锅(DK-80，上海一恒科技有限公司);超声震荡仪(H66MC，美国奥好斯科技有限公司);XW-80A 型快速蜗旋器。穿心莲［Andrographis paniculata (Burm.f.)Nees.］(哈尔滨市圣泰中药饮片加工厂，批号:080501)。乙腈、甲醇(色谱纯，山东禹王);甲酸(色谱纯，上海科锐);自制超纯净水、高氯酸(天津市东方化工厂)。Wistar 雄性大鼠(由哈尔滨医科大学动物中心提供)，体重180～240 g，批号SCXK-(黑)2006-2010。

2 实验方法

2.1 穿心莲体外药材样品制备

精密称取100 g 穿心莲全叶药材，先用3 倍量的95%的乙醇温浸2 h，回流提取3 次，第一次用10倍量提取1.5 h、后两次用7 倍量分提取1 h，合并续滤液55 ℃左右减压回收乙醇浓缩至1/3 体积［7］。

2.2 色谱条件考察

色谱柱:Waters Symmetry ShieldTMRP18 (3. 9 mm × 150 mm，5 μm);保 护柱:Nova-Pak C18 Guard-PakTM;进样量:20 μL;流动相:乙腈-0.2%甲酸水溶液洗脱系统;流速:0.8 mL/min;柱温:30 ℃;检测波长:200～400 nm 全波长扫描，筛选最佳的检测波长。流动相梯度变化程序见表1。

表1 流动相梯度变化程序表Table 1 Gradient elution program of mobile phases

2.3 空白及含药血清的制备

取Wistar 大鼠4 只，称重，依据8 g/100 g［7］剂量灌胃，分别给予蒸馏水和灌胃药液，每次间隔12 h，连续给药3 d，于末次给药后用10%水合氯醛麻醉，取血5 mL，置于一次性5 mL 采血管内，室温放置30 min，待其凝血后，待血凝块收缩血清充分析出后，以3000 rpm 离心10 min，取上清液2 mL 即得空白和含药血清。

2.4 血清样品处理方法考察

针对血清中化学成分的复杂性，以及血中内源性成分的干扰，本实验取Wistar 大鼠4 只，禁食12 h(自由饮水)，称重，按照8 g/100 g，灌胃给予“2.1”项下所制药液后60 min，用10%水合氯醛麻醉，经肝门静脉取血5 mL，全血静置凝结后，置于37 ℃水浴中30 min 取出。然后采取以下3 种方法对血清进行预处理。

2.4.1 高氯酸法 精密吸取0.2 mL 含药血清，加入0.04 mL 0.6%高氯酸，快速混匀10 min，加入重蒸水至1.2 mL，涡旋混匀10 min，15000 rpm 离心20 min，取上清液过0.45 μm 微孔滤膜为含药血清供试品。同法操作制得空白血清供试品。

2.4.2 甲醇法 精密吸取0.2 mL 含药血清，加入甲醇至1.2 mL，涡旋混匀10 min，15000 rpm 离心20 min，取上清液过0.45 μm 微孔滤膜为含药血清供试品。同法操作制得空白血清供试品。

2.4.3 乙酸乙酯法 精密吸取0.2 mL 含药血清，加2 倍量乙酸乙酯萃取，然后以3000 rpm 离心5 min，吸取上清液，水相再加入4 倍量的甲醇，涡旋2 min，然后以3000 rpm 离心5 min，合并上清液，过0.45 μm 微孔滤膜为含药血清供试品。同法操作制得空白血清供试品。

由于不同的血清处理方法表现出不同的HPLC图谱，为了尽可能地表现含药血清的真实面貌，应对含药血清采取尽量少的处理步骤，以减少处理过程对血清化学成分产生的影响。根据以上3 个方法，筛选出处理步骤最少且杂质峰较少、峰形较好的血清处理方法。

2.5 最佳取血时间考察

取Wistar 大鼠4 只，禁食12 h(自由饮水)，称重，按照8 g/100 g，灌胃给予所制药液后0.5 h，1 h、1.5 h、2 h，用10%水合氯醛麻醉，经肝门静脉取血5 mL，全血静置凝结后，置于37 ℃水浴中30 min 取出，甲醇法处理含药血清以供HPLC 分析。取制好的空白血清样品及给药组血清样品各25 μL，进行HPLC 分析，确定最佳的采血时间。

3 实验结果

3.1 血清样品处理方法确定

图1 不同血清处理方法HPLC 色谱图比较Fig.1 Comparison of HPLC chromatograms of different serum processing methods

如图1，高氯酸法和乙酸乙酯法制得的血清样品，引入血中固有杂质较少，但是能够检测的入血成分少，富集能力差，且高氯酸具有强氧化性，给体内成分分析带来干扰，不适合于本研究。甲醇法此方法制得的血清样品，被检测出的入血成分峰较多，分离效果好，富集程度较高，因此确定甲醇法作为本研究的血清样品制备方法。

3.2 最佳取血时间确定

如图2，结果表明，给药后1 h 后的血清样品中，穿心莲的入血成分多，峰型好，而且浓度高，最适于分析。因此，选定1 h 为最佳取血时间。

图2 不同取血时间HPLC 色谱图比较Fig.2 Comparison of HPLC chromatograms of different blood sampling time

3.3 最佳检测波长的确定

本实验采用二极管阵列检测器，在分析时进行全波长紫外扫描(200～400 nm)，并对同一样品提取不同波长下的色谱图，如图3，经比较结果表明，在275 nm 波长下色谱图峰形最好，出峰数目适中，各色谱峰相互之间分离度较好(254 nm 下55 min处峰虽高但峰形不好，对下一步质谱分析帮助不大)，故检测波长定为275 nm。

图3 不同波长下HPLC 色谱图比较Fig.3 HPLC chromatograms of samples with different detection wavelengths

3.4 体内血清指纹图谱建立

如图4，分别吸取体外药材样品、含药血清、空白血清供试品溶液20 μL，注入高效液相色谱仪，记录70 min 色谱图。共在血清样品中发现是10 个成分，通过对比逐个峰的色谱图与光谱图，结果显示，1、4、8、9 号峰为原型成分，2、3、5、6、7、10 号峰推测其为体内代谢产物。

图4 体外药材样品、给药血样、空白血样HPLC 色谱图比较Fig.4 Comparison of HPLC chromatograms of sample directly extracted by rat serum，sample with oral administration of drug and blank rat serum

4 结论

目前对穿心莲的药效作用研究比较广泛，但研究大多限于其解热、抗菌、抗炎等药理学作用。关于穿心莲的生殖毒性及其物质基础，至今尚未见翔实的研究报道。本实验确定了在前期实验［7］已确定有生殖毒性的剂量下给药后1 h，肝门静脉取血后采用甲醇处理的方法，来建立穿心莲血清指纹图谱，并对穿心莲体内成分加以分析，得出10 个成分中，有4 个为原型成分，6 个推测其为穿心莲体内代谢产物，为下一步利用质谱技术分析其成分，代谢途径及其结构演变提供支持，从而为优化穿心莲临床使用的正确的用法、用量，增强用药的安全性以及为把穿心莲开发为一种避孕药提供参考依据。

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