海洋来源小单孢菌Micromonospora rosaria SCSIO N160 中大环内酯类化合物的分离鉴定

张文军，李苏梅，张海波，张庆波，张改云，张光涛，朱义广，张长生

中国科学院南海海洋研究所海洋生物资源可持续利用重点实验室

海洋微生物研究中心 广东省海洋药物重点实验室，广州510301

放线菌是发现微生物药物的一个重要源泉。在迄今报道的13000 多个有生物活性的代谢产物中，超过70%的来源于放线菌［1］。在过去的几十年中，微生物药物的研究主要集中于陆生放线菌，尤其是链霉菌。然而，随着研究工作的持续进行，从中分离得到的代谢产物的重复率逐年增加，开发新的微生物资源越来越具有必要性。高温、低压、寡营养的海洋环境中生活的海洋放线菌形成了独特的代谢途径，从而具备了生产新的次级代谢产物的潜力［2］。在过去的十年中，从海洋放线菌中已经发现了包括salinosporamides、sporolides、cyanosporasides 等在 内的一系列结构新颖、生物活性独特的次级代谢产物［3］。最近，中国科学院南海海洋研究所的科研人员从源于南海或者印度洋海底沉积环境的放线菌中发现了一系列具有抗菌、抗疟原虫和抗肿瘤活性的次级代谢产物［4-6］。本课题组在对南海放线菌的持续研究中，发现源自南海沉积物的小单孢菌Micromonospora rosaria SCSIO N160 能产生抗菌活性的次级代谢产物，对其发酵液进行分离纯化，得到了四个大环内酯类抗生素rosamicin(1)、6108B(2)、M4365-A1(3)和M4365-G1(4)。本文报道了Micromonospora rosaria SCSIO N160 的发酵及化合物1～4 的分离与结构鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂

核磁共振波谱1H NMR、13C NMR 用Bruker DRX2500 核磁共振仪(500/125 MHz)测定，以TMS为内标，CDCl3、CD3OD 作溶剂;质谱ESI-MS 用LCQ DECA XP 液质联用仪，以CHCl3、CH3OH 作溶剂测定。正相用硅胶为100～200 目和300～400 目硅胶(中国烟台)，凝胶为Sephadex LH-20(40～70 μm;Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)，反相硅胶为YMC* GEL ODS-A(12 nm S-50μm;Japan)。薄层层析用硅胶G(silica gel GF254，10～40 nm，烟台)。

1.1.2 菌种

菌株SCSIO N160 分离自深30 m 的南海海底沉积物样品(东经116°17.754'，北纬22°41.083')，经16S rRNA 基因序列(JF508525)鉴定为小单孢菌Micromonospora rosaria ，保藏于中国科学院南海海洋研究所海洋微生物研究中心。

1.1.3 培养基

斜面培养基:酵母膏0.4%，葡萄糖0.4%，麦芽浸膏0.5%，琼脂1.8～2.0%，海盐3%，复合维生素(VB1 0.1 mg，VB6 0.1 mg，核黄素0.1 mg，烟酸0.1 mg，苯丙氨酸0.1 mg，生物素0.1 mg，丙氨酸0.03 mg)，pH 7.2。

种子和发酵培养基:淀粉1%，葡萄糖2%，酵母粉1%，玉米粉0.3%，牛肉膏0.3%，MgSO4·7H2O 0.05%，K2HPO40.05%，CaCO30.2%，海盐3%;pH 7.2。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的发酵

将菌种接种至斜面培养基上，28 ℃培养14 d，接种于种子培养基中，28 ℃，200 rpm 振荡培养6 d作为发酵培养的种子，将生长良好的种子以10%(v/v)的接种量接入发酵培养基中(400 mL 培养基/2000 mL 三角瓶)，28 ℃，200 rpm 培养4 d，加入XAD-16 大孔树脂，24 h 后收集大孔树脂备用。

1.2.2 提取与分离

收集大孔树脂，用4 L 水洗脱盐，后用丙酮洗脱，旋转蒸发回收丙酮，水相用丁酮萃取，旋转蒸发丁酮萃取液得到4 g 粗品。粗品用氯仿(C):甲醇(M)溶解拌样上硅胶柱(100～200 目)，C:M 线性梯度洗脱，收集馏份，结合HPLC 分析，抑菌活性检测合并馏份，得4 个馏份Fr.1-Fr.4，Fr.2 上Sephadex LH20，C:M 洗脱收集馏份，结合HPLC 分析，抑菌活性检测合并馏份，得馏份Fr.2-A—Fr.2-H，馏份Fr.2-C 上中压液相柱，甲醇:水线性梯度洗脱得到rosamicin(1)，馏份Fr.2-D 上中压液相柱，甲醇:水线性梯度洗脱得到6108B(2)，馏份Fr.2-E 用高压液相制备，流动相为乙腈:水，制备得M4365-A1(3)，馏份Fr.2-F 用高压液相制备，流动相为乙腈:水，制备得M4365-G1(4)。

2 化合物的结构鉴定

化合物1～4 的结构(图1)通过对ESI-MS、1H NMR、13C NMR 的分析及与参考文献比较来确定。

图1 化合物1～4 的化学结构Fig.1 Chemical structures of compounds 1-4

化合物1 白色粉末，ESI-MS m/z 582 ［M +H］+，604 ［M + Na］+，确定其分子量为581。结合1H NMR 和13C NMR 分析，确定其分子式为C31H51NO9。1H NMR (CDCl3，500 MHz)δ :9.72 (1H，s，H-20)，6.54 (1H，d，J=16.0 Hz，H-11)，6.44 (1H，d，J =16.0 Hz，H-10)，4.87 (1H，m，H-15)，4.22 (1H，d，J=7.5 Hz，H-1')，3.90 (1H，br d，J =10.0 Hz，H-3)，3.70 (1H，br d，J = 10.0 Hz，H-5)，3.45(1H，m，H-5')，3.19 (1H，dd，J =10.0，7.5 Hz，H-2')，3.07 (1H，m，H-19a)，2.82 (1H，d，J=9.0 Hz，H-13)，2.65 (1H，dd，J = 17.0，10.0 Hz，H-2a)，2.56 (1H，m，H-8)，2.43～2.47 (3H，m，H-6，H-19b，H-3')，2.27 (6H，s，H-7'，H-8')，2.09 (1H，d，J =10.5 Hz，H-2b)，1.76-1.82 (2H，m，H-16a，H-4)，1.63-1.72 (2H，m，H-7，H-4' a)，1.48-1.54(2H，m，H-14，H-16b)，1.42 (3H，s，H-22)，1.24(1H，m，H-4'b)，1.19 (3H，d，J =9.0 Hz，H-6')，1.15 (3H，d，J =7.0 Hz，H-21)，1.14 (3H，d，J =2.5 Hz，H-23)，1.12 (3H，d，J = 7.5 Hz，H-18)，0.88 (3H，d，J =7.0 Hz，H-17);13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ :173.4 (C，C-1)，39.6 (CH2，C-2)，66.7 (CH，C-3)，41.2 (CH，C-4)，81.1 (CH，C-5)，31.1 (CH，C-6)，31.7 (CH2，C-7)，37.8 (CH，C-8)，200.4 (C，C-9)，122.7 (CH，C-10)，150.9 (CH，C-11)，59.7 (C，C-12)，67.9 (CH，C-13)，45.1(CH，C-14)，76.8 (CH，C-15)，24.7 (CH2，C-16)，8.9 (CH3，C-17)，9.0 (CH3，C-18)，43.7 (CH2，C-19)，203.1 (CH，C-20)，17.4 (CH3，C-21)，15.0(CH3，C-22)，14.5 (CH3，C-23)，104.3 (CH，C-1')，70.3 (CH，C-2')，65.7 (CH，C-3')，28.4 (CH2，C-4')，69.6 (CH，C-5')，21.1 (CH3，C-6')，40.2(CH3，C-7'，8')。以上波谱数据与文献一致［7，8］，故将化合物1 鉴定为rosamicin。

化合物2 白色粉末，ESI-MS m/z 598 ［M +H］+，620 ［M + Na］+，提示其分子量为597。结合1H NMR 和13C NMR 分析，确定其分子式为C31H51NO10。1H NMR (CD3OD，500 MHz)δ :8.37 (1H，s，H-20)，6.73 (1H，d，J=15.7 Hz，H-11)，6.48 (1H，d，J =15.7 Hz，H-10)，4.86 (1H，m，H-15)，4.31(1H，d，J=6.6 Hz，H-1')，3.97 (1H，br d，J=10.0 Hz，H-3)，3.78 (1H，br d，J =10.0 Hz，H-5)，3.43-3.49 (2H，m，H-19a，H-5')，3.65 (1H，m，H-13)，2.93 (1H，m，H-2')，2.92 (1H，m，H-6)，2.87 (1H，m，H-19b)，2.86 (6H，s，H-7'，8')，2.67 (1H，m，H-8，H-3')，2.38 (1H，d，J = 17.0 Hz，H-2a)，2.29(1H，d，J =17.0 Hz，H-2b)，2.03 (1H，d，J =11.0 Hz，H-4)，1.84-1.97 (3H，m，H-16a，H-4'a，H-7)，1.79 (1H，m，H-14)，1.56(1H，m，H-16b)，1.50(3H，s，H-22)，1.47 (1H，m，H-4'b)，1.33 (3H，d，J=6.0 Hz，H-6')，1.20 (3H，d，J =7.0 Hz，H-21)，1.15 (3H，d，J =6.0 Hz，H-23)，1.10 (3H，d，J =6.0 Hz，H-18)，0.93 (3H，J =7.0 Hz，H-17);13C NMR (CD3OD，125 MHz)δ :174.0 (C，C-1)，41.0(CH2，C-2)，67.4 (CH，C-3)，42.7 (CH，C-4)，82.2(CH，C-5)，32.5 (CH，C-6)，34.5 (CH2，C-7)，39.1(CH，C-8)，203.4 (C，C-9)，124.5 (CH，C-10)，152.5 (CH，C-11)，61.2 (C，C-12)，69.0 (CH，C-13)，46.6 (CH，C-14)，78.0 (CH，C-15)，25.6(CH2，C-16)，9.4 (CH3，C-17)，9.6 (CH3，C-18)，39.1 (CH2，C-19)，174.0 (C，C-20)，17.6 (CH3，C-21)，15.3 (CH3，C-22)，14.7 (CH3，C-23)104.6(CH，C-1')，70.3 (CH，C-2')，66.9 (CH，C-3')，31.2 (CH2，C-4')，69.6 (CH，C-5')，21.0 (CH3，C-6')，41.1 (CH3，C-7'，8')。以上波谱数据与文献一致［7］，故将化合物2 鉴定为6108B(2)。

化合物3 白色粉末，ESI-MS m/z 568 ［M +H］+，590 ［M + Na］+，提示其分子量为567。结合1H NMR 和13C NMR 分析，确定其分子式为C31H53NO8。1H NMR (CD3OD，500 MHz)δ :6.71 (1H，J=15.6 Hz，H-11)，6.45 (1H，J =15.7 Hz，H-10)，4.82 (1H，m，H-15)，4.36 (1H，d，J =6.0 Hz，H-1')，3.83 (1H，m，H-5)，3.80 (1H，m，H-3)，3.62-3.70 (2H，m，H-5'，H-2')，3.43-3.47 (2H，m，H-19a，H-13)，2.89 (6H，m，H-7'，H-8')，2.85 (1H，m，H-3')，2.61-2.67 (2H，m，H-19b，H-8)，2.29(1H，m，H-2)，2.06 (1H，m，H-2)，1.83-1.92 (4H，m，H-6，H-4'a，H-7，H-16a)，1.76 (1H，m，H-4)，1.67 (1H，m，H-14)，1.54 (1H，m，H-4'b)，1.49(3H，s，H-22)，1.43 (1H，m，H-16b)，1.19 (3H，d，J=7.0 Hz，H-6')，1.14 (3H，d，J =7.0 Hz，H-23)，1.11 (3H，J=7.0 Hz，H-18)，0.89 (3H，t，J =7.0 Hz，H-20);13C NMR (CD3OD，125 MHz)δ :174.4(C，C-1)，41.3 (CH2，C-2)，67.3 (CH，C-3)，46.7(CH，C-4)，81.0 (CH，C-5)，42.3 (CH，C-6)，34.1(CH，C-7)，49.0 (CH，C-8)，203.9 (C，C-9)，125.6(CH，C-10)，152.1 (CH，C-11)，61.2 (C，C-12)，69.3 (CH，C-13)，40.6 (CH，C-14)，78.1 (CH，C-15)，22.2 (CH2，C-16)，9.5 (CH3，C-17)，9.9(CH3，C-18)，25.6 (CH2，C-19)，12.5 (CH3，C-20)，17.0 (CH3，C-21)，15.3 (CH3，C-22)，14.6(CH3，C-23)，104.7 (CH，C-1')，70.4 (CH，C-2')，67.1 (CH，C-3')，31.2 (CH，C-4')，69.6 (CH，C-5')，21.1 (CH3，C-6')，39.1 (CH3，C-7'，8')。以上波谱数据与文献一致［9，10］，故将化合物3 鉴定为M-4365 A1。

化合物4 白色粉末，ESI-MS m/z 552 ［M +H］+，574 ［M + Na］+，提示其分子量为551。结合1H NMR 和13C NMR 分析，确定其分子式为C31H53NO7。1H NMR (CD3OD，500 MHz)δ :7.26 (1H，d，J=15.0 Hz，H-11)，6.46 (1H，d，J =15.0 Hz，H-10)，5.69 (1H，d，J =10.0 Hz，H-13)，4.71 (1H，m，H-15)，4.33 (1H，d，J = 5.0 Hz，H-1')，3.81(1H，br d，J=9.0 Hz，H-3)，3.74 (1H，d，J =10.0 Hz，H-5)，3.67 (1H，m，H-5')，3.42-3.44 (1H，br s，H-19a，H-2')，2.90 (1H，s，H-7')，2.81 (1H，s，H-8')，2.66 (1H，m，H-3')，2.52 (1H，m，H-8)，2.30(1H，br s，H-2)，2.04～2.07 (2H，m，H-2，H-19b)，1.87 (3H，s，H-22)，1.74-1.79 (3H，m，H-16a，H-14，H-6)，1.61～1.64 (2H，m，H-7，H-4'a)，1.45-1.47 (3H，m，H-4，H-16b，H-4'b)，1.30 (3H，s，H-6')，1.22 (3H，d，J =7.0 Hz，H-21)，1.10 (3H，d，J=6.5 Hz，H-23)，1.06 (3H，d，J=7.0 Hz，H-18)，0.96 (3H，t，J =7.5 Hz，H-20)，0.88 (3H，t，J =7.0 Hz，H-17);13C NMR (CD3OD，125 MHz)δ :175.0 (C，C-1)，41.2 (CH，C-2)，68.4 (CH，C-3)，46.5 (CH，C-4)，80.9 (CH，C-5)，40.1 (CH，C-6)，34.9 (CH，C-7)，49.0 (CH，C-8)，203.8 (C，C-9)，120.5 (CH，C-10)，149.7 (CH，C-11)，134.9 (CH，C-12)，147.8 (CH，C-13)，37.5 (CH，C-14)，80.1(CH，C-15)，22.2 (CH2，C-16)，9.6 (CH3，C-17)，10.0 (CH3，C-18)，25.7 (CH2，C-19)，12.5 (CH3，C-20)，17.9 (CH3，C-21)，16.3 (CH3，C-22)，13.1(CH3，C-23)，104.5 (CH，C-1')，70.4 9 (CH，C-2')，67.1 (CH，C-3')，31.3 (CH，C-4')，69.2 (CH，C-5')，21.1 (CH3，C-6')，42.4 (CH，C-7'，8')。以上波谱数据与文献一致［9，10］，故将化合物4 确定为M4365-G1。

Rosamicin 具有广谱抗菌活性，尤其对于G+菌Staphylococcus aureus 和Diplococcus pneumoniae 有显著的抑制活性。Rosamicin 首次由Wagman 等从Micromonospora rosaria IFO 13697 (NRRL No.3718)发酵液中分离得到。1990 年，Mohindar 等和Shigeru等分别报道了rosamicin 的数个同系物［7，9］。本文是首次报道从海洋来源的放线菌在高盐的培养条件下得到rosamicin(1)及其同系物6108B(2)，juvenimicin A2(3)和M4365-G1(4)。

致谢:非常感谢南海海洋研究所的李传荣老师、肖志慧老师及孙爱君老师在核磁数据方面提供的帮助，同时感谢华南植物园的刘俭老师在质谱数据方面提供的帮助。

1 Berdy J. Bioactive microbial metabolites. J Antibiot，2005，58:1-26.

2 Jensen PR，Gontang E，Mafnas C，et al.Culturable marine actinomycete diversity from tropical Pacific Ocean sediments.Environ Microbiol，2005，7:1039-1048.

3 Fenical W，Jensen PR，Palladino MA，et al. Discovery and development of the anticancer agent salinosporamide A(NPI-0052).Bioorg Med Chem，2009，17:2175-2180.

4 Zhang QB，Mándi A，Li SM，et al. N-N-coupled indolo-sesquiterpene atropo-diastereomers from a marine-derived actinomycete.Eur J Org Chem，2012，27:5256-5262.

5 Li SM(李苏梅)，Tian XP(田新朋)，Niu SW(牛四文)，et al. Antimycins from marine Streptomyces sp. SCSIO 1635 from the South China Sea.Nat Prod Res Dev (天然产物研究与开发)，2011，23:10-14.

6 Zhang WJ，Liu Z，Li SM，et al. Spiroindimicins A-D:new bisindole alkaloids from a Deep-Sea-Derived actinomycete.Org Lett，2012，14:3364-3367.

7 Nakajima S，Kojiri K，Morishima H，et al.New analogs of rosaramicin isolated from a Micromonospora strain.II.Structure determination.J Antibiot，1990，43:1006-1009.

8 Anzai Y，Sakai A，Li W，et al. Isolation and characterization of 23-O-mycinosyl-20-dihydro-rosamicin:a new rosamicin analogue derived from engineered Micromonospora rosaria. J Antibiot，2010，63:325-328.

9 Puar MS，Schumacher.Novel macrolides from Micromonospora rosaria.J Antibiot，1990，43:1497-1501.

10 Kinumaki A，Harada KI，Suzuki T，et al.Macrolide antibiotics M-4365 produced by Micromonospora. II. Chemical structures.J Antibiot，1977，30:450-454.