竹节参培养细胞提取的竹节参总皂苷对大鼠佐剂性关节炎的抑制作用

2013-12-23刘玉萍王金萍郭志刚

天然产物研究与开发 2013年6期

刘玉萍，王金萍，郭志刚*

1清华大学化工系，北京100084;2 北京军区总医院药理科，北京100700

竹节参(Panax japonicus C.A.Meyer)是五加科人参属植物，以根状茎及肉质根入药，性味甘苦、温，具有滋补强壮、活血化淤、消肿止痛的功效，是我国的名贵中药材。由于竹节参的自然种群分布稀少，野生资源濒临灭绝，已被列为国家保护植物。科研人员已经从竹节参分离到多种化学成分。主要包括竹节参皂苷、氨基酸、糖类及无机微量元素等［1］。刘家兰等发现竹节人参提取物的镇痛和中枢性镇痛作用明显［2］。闵静等发现竹节参皂苷具有良好的免疫调节作用，对于类风湿性关节炎有较好的抗炎作用［3］。王洪武等研究了竹节参皂苷与多糖组合物对免疫低下小鼠免疫功能有促进作用［4］。刘玉萍等的研究证明了竹节参总皂苷具有良好的镇痛作用［5］。

由于竹节参的产量很低，自然资源有限，本实验采用竹节参细胞培养提取的竹节参总皂苷，通过Wistar 大鼠构建免疫炎症病理模型，通过口服给药，研究竹节参总皂苷对于Wistar 大鼠佐剂性免疫炎症的治疗效果。目的是了解由竹节参培养细胞获得的竹节参皂苷在提高机体免疫力的效果。同时也验证竹节参总皂苷的药效。

1 材料与方法

1.1 实验材料

Wistar 大鼠，雄性，体重180 ±10 g，购自中国医学科学院实验动物繁殖场，合格证号SCXK(京)-2006-0003。每组10 只，合计60 只。竹节参细胞培养总皂苷由清华大学化工系生物化工研究所提供。阳性对照药雷公藤多苷片由上海复旦复华药业有限公司提供，10 mg/片(批号:060901)。弗氏完全佐剂由美国 Sigma 公司提供，10 mL/支(批号:124k8942)。

分别称取适量的竹节参总皂苷粉末，用0.5%Carboxymethyl cellulose-Na(CMC-Na)配成不同浓度:竹节参总皂苷的浓度分别为1、2、4 mg/mL，阳性对照药物雷公藤多苷的浓度为1 mg/mL。

1.2 病理模型构建

1.2.1 佐剂性关节炎(AA)大鼠模型的制备［6］

将动物随机分为正常对照组、模型组、阳性药雷公藤多苷组、竹节参总皂苷高、中、低剂量组。口服给药，正常对照组和模型组给予等体积0.5% CMCNa，于末次给药1 h 后每只动物右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂0.1 mL 致炎。

1.2.2 给药方案

1)致炎前5d 口服给药，观察药物对原发性病变的预防效果;在致炎7 d 后连续用药5 d，观察药物对原发性病变的治疗作用;2)在致炎后第12 d 再次开始连续用药10 d，以观察竹节参总皂苷对继发病变的治疗作用。3)阳性药组每日口服给雷公藤多苷40 mg/kg，竹节参总皂苷低、中、高剂量组每日口服给药分别为35、70 和140 mg/kg，正常对照组和模型组给予等体积0.5% CMC-Na。

1.2.3 AA 大鼠原发性病变观察

测量致炎后第6、18 和24 h AA 大鼠的足肿胀度。观察AA 大鼠原发性病变。

足肿胀度=(致炎后足体积﹣致炎前足体积)/致炎前足体积，用此公式来计算足肿胀度，此值反映原发性炎症病变的影响。

1.2.4 AA 大鼠继发性病变观察

由于继发性病变一般表现在致炎第10 d 以后，所以在致炎后第12 d 再次开始连续口服给药10 d，并于第3、12、15、18、21 和24 d 检测致炎和非致炎侧足的肿胀情况(测量大鼠左、右后足体积)，观察药物对AA 大鼠继发性病变的治疗效果，并计算非致炎侧足的肿胀度。

1.2.5 数据统计分析

对AA 大鼠的体重、原发性足肿胀度、继发性足肿胀度进行了检测和调查。数据为10 只实验大鼠的平均数和偏差，同时进行了t 测验分析。

1.2.6 AA 大鼠的病理改变

于造模后第28 d 颈动脉放血处死大鼠，取各组大鼠踝关节置于10%福尔马林中固定，24 h 后换新福尔马林继续固定48 h。选取组织经常规脱水，石蜡包埋，切5 μΜ 薄片，HE 染色，光镜检查，并照相。

2 实验结果

2.1 竹节参总皂苷对AA 大鼠体重的影响

在造模期间，各组大鼠体重均明显逐步增加。结果见表1。竹节参总皂苷各剂量和阳性药雷公藤多苷给药没有对AA 大鼠的基本生长发育造成伤害。由于模型组和各给药组与对照组相比AA 大鼠的体重没有显著性差异，体重实验结果不存在系统性误差。

表1 竹节参总皂苷对AA 大鼠体重的影响(±s，n=10)Table 1 Effects of PJTS on the weight of AA rats (±s，n=10)

组别Group剂量Dose(mg/kg)0 d3 d15 d18 d21 d24 d 12.4 ±27.3319.8 ±34.8336.3 ±36.7模型组Model－187.3 ± 6.8203.7 ± 9.2279.5 ±19.8308.4 ±25.0319.2 ±26.0333.7 ±29.3阳性组Positive conturol40186.0 ± 7.7200.7 ±11.4282.0 ±22.4311.6 ±15.1320.2 ±23.4332.4 ±34.0低剂量PJTS low dose35184.7 ± 7.5205.2 ± 9.3283.7 ±12.2311.7 ±15.1320.2 ±23.4336.0 ±17.7中剂量PJTS Moderate dose70184.7 ± 6.6200.3 ± 9.2272.8 ±20.2302.3 ±23.6303.8 ±21.5325.4 ±22.4高剂量PJTS High dose140186.0 ± 7.7200.8 ±10.1276.5对照组Control－184.5 ±12.2208.5 ±16.6278.9 ±28.03±17.4297.0 ±34.9304.6 ±21.6326.9 ±25.1

2.2 竹节参总皂苷对AA 大鼠原发性足肿胀度的影响

致炎前连续口服给药5 d 后开始致炎的实验结果如表2，除了对照组AA 大鼠原发性足肿胀度没有变化之外，模型组、阳性药组与竹节参总皂苷各剂量组分别从致炎后开始肿胀，第6 h 各组以模型组为最大的0.5，阳性组和中剂量竹节参皂苷给药组的肿胀度分别为0.3，显著低于模型组。第12 h 后模型组的肿胀度达到0. 7，低剂量竹节参给药组为0.6，而中剂量和高剂量给药组的肿胀度只有0.4，显著低于模型组和低剂量给药组，并且好于阳性组。第18 h 后模型组的肿胀度达到0.9，而中剂量竹节参皂苷给药组的肿胀度维持在0.4，显著低于模型组、低剂量组、高剂量组和阳性组。第24 h，模型组的肿胀度下降为0.7，而中剂量竹节参皂苷给药组的肿胀度依然稳定在0.4，显著低于模型组和阳性对照。实验结果表明，中剂量组处理对于预防和治疗AA 大鼠原发性足肿胀具有良好的效果，低剂量组和高剂量组的抗炎效果与阳性药组基本相同。表明竹节参皂苷对于AA 大鼠的原发性炎症具有很好的预防和治疗效果。

表2 竹节参总皂苷对AA 大鼠原发性足肿胀度的影响(±s，n=10，T-test * p ＜0.05，＊＊p ＜0.01)Table 2 Effects of PJTS on the primary foot swelling degree of AA rats (±s，n=10，T-test * p ＜0.05，＊＊p ＜0.01)

组别Group剂量dose(mg/kg)致炎后的足肿胀度(mL)Cause inflammation after of the foot degree (mL)0 h6 h12 h18 h24 h对照组Control-0.0 ±0.0＊＊0.0 ±0.0＊＊0.0 ±0.0＊＊0.0 ±0.0＊＊0.0 ±0.0＊＊模型组Model0.0 ±0.00.5 ±0.30.7 ±0.20.9 ±0.30.7 ±0.3阳性组Positive control400.0 ±0.00.3 ±0.2*0.5 ±0.2*0.6 ±0.1*0.5 ±0.1*低剂量组PJTS low dose350.0 ±0.00.4 ±0.10.6 ±0.20.6 ±0.1*0.5 ±0.1*中剂量组PJTS Moderate dose700.0 ±0.00.3 ±0.1*0.4 ±0.2＊＊0.4 ±0.2＊＊0.4 ±0.1＊＊高剂量组PJTS High dose1400.0 ±0.00.4 ±0.10.4 ±0.1＊＊0.6 ±0.1*0.5 ±0.2*

2.3 竹节参总皂苷对AA 大鼠继发性足肿胀度的影响

竹节参总皂苷对AA 大鼠继发性足肿胀度的消炎和治疗实验自致炎后第12 d 起又继续口服给药，同时观察AA 大鼠继发性病变的情况。实验结果如表3 所示，在致炎后第12 d，模型组和低剂量竹节参皂苷给药组的足肿胀度为0.5，阳性药组以及中、高剂量竹节参总皂苷给药组的足肿胀度分别为0.3～0.4，表明在致炎前口服给药5 d 的抗炎效果依然存在。模型组的个别大鼠有结节出现，并伴有体重减轻等症状。从致炎后第12 d 起开始二次用药，3 d后也就是在第15 d，模型组的足肿胀度降低到0.3，而阳性药组和低剂量竹节参皂苷给药组的足肿胀度降低到0.1，中剂量和高剂量竹节参皂苷给药组的足肿胀度降低到0。在用药后第6 d(18 d)模型组的肿胀度仍然维持在0.3，阳性药组和低剂量给药组的肿胀度也降低到0，极显著地低于模型组的足肿胀度，表现出竹节参皂苷良好的消炎与消肿效果。致炎后第12 d 模型组与各处理组的原发性足肿胀度虽然均有所下降，但是仍维持在0.5～0.3 范围内。再次开始给药后，给药组分别在第15 d 和18 d均彻底消除了足肿胀，达到了很好的治疗效果。实验结果充分证明竹节参总皂苷对于AA 大鼠继发性炎症具有很好的治疗效果。

结合大鼠原发性与继发性足肿胀的结果可以清楚地看到，自致炎开始AA 大鼠的右足开始肿胀，在第6 h，除了对照组之外，各处理组的AA 大鼠的原发性足肿胀度均达到了0.3～0.5，在第16 h 足肿胀度达到最高峰，之后开始消肿。同时可以看到，在致炎前5 d 开始口服给药的AA 大鼠的足肿胀度均显著低于模型组。表明竹节参皂苷和雷公藤多苷对于AA 大鼠的原发性炎症具有很好的预防效果。在致炎后第12 d 模型组与各处理组的原发性足肿胀度虽然均有所下降，但是仍维持在0.5～0.3 的范围内。再次开始给药后发现，给药组分别在第15 d和18 d 均彻底消除了足肿胀，达到了很好的治疗效果。实验结果充分证明了竹节参总皂苷对于AA 大鼠原发性和继发性炎症都具有良好的治疗效果。特别是中高级量的治疗效果要优于雷公藤多苷。

表3 竹节参总皂苷对AA 大鼠继发性足肿胀度的影响(±s，n=10，T-test * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01)Table 3 Effects of PJTS on the secondary foot swelling degree of AA rats (±s，n=10，T-test * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01)

组别Group剂量Dose(mg/kg)致炎后的足肿胀度(mL)Cause inflammation after of the foot degree(mL)12 d15 d18 d对照组Control－0.1 ±0.1＊＊0.1 ±0.1＊＊0.0 ±0.1＊＊模型组Model－0.5 ±0.20.3 ±0.10.3 ±0.1阳性组Positive control400.4 ±0.1*0.1 ±0.1＊＊0.0 ±0.1＊＊低剂量组PJTS Low dose350.5 ±0.10.1 ±0.1＊＊0.0 ±0.1＊＊中剂量组PJTS Moderate dose700.4 ±0.1*0.0 ±0.2＊＊0.0 ±0.1＊＊高剂量组PJTS High dose1400.3 ±0.1*0.0 ±0.1＊＊0.0 ±0.1＊＊

2.4 竹节参总皂苷对AA 大鼠足爪关节病理组织的影响

实验结束后，在光镜下观察足爪组织并摄片。病理分级为:0 级:足爪组织结构无名显异常。Ⅰ级:足爪组织有少量炎性细胞浸润。Ⅱ级:足爪组织有较多炎性细胞浸润。Ⅲ级:足爪组织有大量炎性细胞浸润，伴明显间质水肿。

足爪组织病理切片见图1。对照组的关节滑膜组织由1～2 层滑膜细胞及滑膜下层组成，可见少许小血管，滑膜细胞排列整齐，关节面光滑，腔内无渗出，属于0 级无炎症的正常组织。而AA 大鼠足爪模型组织的病理切片发现明显有增生、肉芽肿、巨噬细胞，滑膜囊内有大量炎性细胞，伴明显间质水肿，其病理分级属于Ⅲ级。而竹节参总皂苷处理组和阳性组的病理切片虽然存在轻微的细胞浸润现象，但是没有增生和肉芽肿等严重间质水肿发生。其病理分级应该处于0～Ⅰ级之间。表明竹节参皂苷对于AA 大鼠的关节炎症具有明显的治疗作用。

图1 竹节参总皂苷对AA 大鼠足爪关节病理组织的影响(HE 染色，×100)Fig.1 Effects of PJTS on the foot claw joint pathology organization of AA rats

3 讨论

炎症(inflammation)是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应。任何损伤因子在引起细胞和组织损伤的同时，也刺激生物体产生防御反应。它是人类疾病中一种最常见的病理、生理过程，可以发生于机体的任何部位和任何组织［7］。当致炎因子作用于机体时，机体通过炎症反应消除致炎因子，保护机体免受异物或致病因素的损害，同时又通过自身抗炎机制限制炎症的范围，维持机体的稳态。整个过程中实际贯穿着两对主要矛盾:损害与抗损害，炎症与抗炎症的斗争，两对矛盾关系密切，相互依赖，两者的力量对比变化决定了炎症的发生和发展。机体在正常情况下，如果有病原体入侵，会诱导炎性细胞活化、补体活化以及炎症介质的产生。同时，会动员机体自身抗炎机制限制这种活化，保护宿主免受炎症损伤。结果是损害与抗损害，炎症与抗炎症在机体达成一种平衡，当这一平衡由于外在因素(如致炎因子的强烈攻击)或内在因素(如自身抗炎机制减弱)而失调时，即可出现病理学上炎症反应:红、肿、热、痛及肉芽组织形成。

大鼠AA 模型是一种免疫性炎症模型，主要以细胞免疫功能紊乱而导致关节损伤的一种关节炎模型。一般分两个时相，即原发性和继发性反应期，其中原发性反应为非特异性急性炎症，而继发性反应则是免疫功能紊乱造成免疫性炎症表现。本研究根据以往的成功经验，选用Wistar 雄性大鼠右后足皮内注射完全弗氏佐剂造模，观察竹节参总皂苷对AA 大鼠模型的影响。测量和观察注射足的初始肿胀度以反映AA 大鼠原发性炎症变化，当注射完全弗氏佐剂18 h 后注射足肿胀达到高峰，以后肿胀度逐渐相对下降。观察AA 大鼠继发性病变的结果显示，大鼠于致炎后第10 d 起其左足也开始肿胀，第18 d 达到肿胀高峰，由于迟发型超敏反应，使侧后肢、前肢各关节周围等部位均出现红肿、红斑、个别模型动物出现炎性结节，且进行性加重，模型动物伴有行动不便等全身性症状。而口服竹节参总皂苷的大鼠不仅能有效抑制原发性炎症，也明显地抑制了AA 大鼠的继发性炎症。通过病理切片进行组织学观察，模型组的滑膜组织明显增生，肉芽肿形成，巨噬细胞及滑膜囊内大量炎性细胞浸润，关节软骨侵蚀及骨组织破坏，与人类的类风湿关节炎(RA)十分相似［8］。而口服竹节参总皂苷的大鼠明显地减轻了关节炎性细胞的浸润、促进巨噬细胞的形成。该试验结果为解释文献记载的竹节参能够治疗风湿痹症提供了实验依据。

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