番茄叶水提物急性毒性及其对急性炎症的影响

阎 莉，邓家刚，卫智权

广西中药药效研究重点实验室广西中医药大学，南宁530001

番茄叶为茄科多年生草本植物番茄(Lycopersicon esculentum Mill)的叶，具有特殊气味，这些气味来自一些特殊的天然挥发性成分，主要为β-水芹烯、3-己烯醇、2-己烯酮、2-己烯醇及2-甲基-N-苯基-2-丙烯酰胺(5)、邻苯二甲酸丁基(8-甲基壬基)二酯(10)等罕见的含氮化合物［1，2］。虽然体外研究显示番茄叶提取物可抑制某些病原微生物［3］，但其是否对病原微生物感染引起的急性炎症具有抗炎作用则未见文献报道。本研究以脂多糖诱导急性炎症大鼠为研究对象，观察番茄叶水提物的急性毒性及其对脂多糖诱导急性炎症的影响，初步评估番茄叶水提物的抗急性炎症活性。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF 级昆明种小鼠，体重18～22 g，雌雄各半，购自广西医科大学实验动物中心(生产许可证号:SCXK 桂2003-0003)。SPF 级健康雄性SD 大鼠60只，体重220～240 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司(实验动物生产许可证号SCXK(湘)2009-0004)。

1.2 药品及试剂

番茄叶来源于广西百色国家农业科技园区优质无公害蔬菜产业化示范园。干燥、粉碎后经水提取、浓缩3 次后得到流浸膏(每mL 相当于原生药3.226 g)，备用。戊巴比妥钠，北京化学试剂公司产品。醋酸泼尼松片，浙江仙琚制药股份有限公司产品。大肠杆菌脂多糖，美国Sigma 公司产品(血清型O55:B5)。白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的ELISA 试剂盒均为美国R＆D 公司产品(201011)。

1.3 仪器设备

Multiskan MK3 酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific 公司产品。

2 实验方法

2.1 急性经口毒性试验

用SPF 级小鼠进行急性毒性试验。经预试验确定其最大致死剂量为90 g/kg，最小致死剂量为20 g/kg，以90 g/kg 为初始剂量，以1∶0.75 为组距设定6 个组。动物禁食不禁水12 h 后，一次灌胃给药，给药容积40 mL/kg，连续观察14 d，每日记录小鼠的毒性反应及死亡数，按改良寇氏法计算半数致死量(LD50)。

2.2 番茄叶水提物对血清炎症细胞因子水平的影响

以1/10 LD50剂量和1/20 LD50剂量为番茄叶水提取物高剂量(3.19g/kg，TLAE-H)和低剂量(1.59 g/kg，TKAE-L)。50 只大鼠分为正常组、模型组、阳性对照药物泼尼松(PNS，5 mg/kg)组、TLAE-H 组和TKAE-L 组。每组10 只，均灌胃给药。给药第9 天后，腹腔注射LPS(4 mg/kg)建立急性炎症动物模型。12 h 后以2%戊巴比妥钠40 mg/kg 腹腔注射麻醉，下腔静脉穿刺取血，室温静置30 min 后于4oC 离心(4000 rpm，5 min)，分离血清，冻存于-70oC备测血清IL-1、IL-6、TNF-α。

采用IL-1、IL-6、TNF-α 的ELISA 检测试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作。以Expert Curve 1.3.8 曲线拟合软件计算标准曲线的直线回归方程，分别计算样品浓度。

2.3 统计学处理

所有计量资料均以均数±标准差(x ±s)表示，以SPSS 13.0 统计软件进行多个样本间均数比较，以P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 急性经口毒性试验

给药后小鼠出现自由活动减少，精神萎靡，身毛竖起，反应迟钝，静卧不动等症状，并有死亡情况发生。结果参见表1。按改良寇氏法计算，番茄叶水提物单次灌胃给药的LD50为46.44 g/kg，其95%可信限为39.52～54.60 g/kg。

表1 口服不同剂量番茄叶水提物的小鼠死亡率Table 1 Mortality of mice with different doses of oral TLAE

3.2 番茄叶水提物对血清炎症细胞因子水平的影响

腹腔注射LPS 后，大鼠血清炎性细胞因子IL-1、IL-6、TNF-α 水平均明显增加而显著高于正常组(P均＜0. 01)。PNS 组、TLAE-H 组血清IL-1、IL-6、TNF-α 水平均明显低于模型组，TLAE-L 组血清IL-1、IL-6 水平低于模型组，差异均有统计学意义(P ＜0.01 或P ＜0.05)。而TLAE-L 组血清TNF-α 水平虽然略低于模型组，但差异无统计学意义(P ＞0.05)。结果见表2。

表2 各组大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α 水平(n=10，±s)Table 2 Levels of rat serum IL-1，IL-6and TNF-α in each group (n=10，±s)

表2 各组大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α 水平(n=10，±s)Table 2 Levels of rat serum IL-1，IL-6and TNF-α in each group (n=10，±s)

组Group剂量Does(g/kg)IL-1(ng/L)IL-6(ng/L)TNF-α(ng/L)正常组Control－297.86 ±81.46282.88 ±54.0239.95 ±9.62模型组Model0.004381.00 ±78.26▲▲357.41 ±63.23▲▲53.70 ±10.34▲▲

注:与空白组比较，▲▲P ＜0.01;与模型组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared with control，▲▲P ＜0.01.Compared with PNS，* P ＜0.05;＊＊P ＜0.01.

4 讨论

中国是最主要的番茄及其副产品生产国之一，番茄叶资源极为丰富，然而番茄叶一直作为农业废弃物处置而未加以利用［4］。番茄叶的化学成分较复杂，国内外对其研究甚少，主要研究了其挥发性气味组成［1，2］，但对其水溶性成分的化学及药理研究尚未见报道。

体外抑菌药理研究显示，番茄叶丙酮提取物对多种病原微生物具有较强的抑菌作用［3］。然而，番茄叶水提物对这些常见致病菌感染导致的急性感染性炎症是否具有抗炎活性仍未见文献报道。对番茄叶进行抗炎活性研究，有助于农业废弃物的开发利用，变废为宝，有利于农业的可持续发展。

革兰阴性菌外膜的LPS 是介导急性感染性炎症损伤的最主要的病原分子之一，许多疾病与LPS诱导的炎症密切相关［5，6］。LPS 进入血液循环后可迅速导致IL-1、IL-6、TNF-α 等炎性细胞因子的大量表达并释放入血，可以作为评价LPS 诱导的急性炎症的参照指标［7，8］。本研究中，模型组大鼠接受LPS注射后其血清IL-1、IL-6、TNF-α 水平均显著上升，提示LPS 成功诱导了具有急性炎症的大鼠模型。TLAE-H 与TLAE-L 组大鼠血清IL-1、IL-6 水平均明显低于模型组，但仅在TL-H 组观察到血清TNF-α的明显降低，此结果一方面表明番茄叶水提物具有较明显的抑制LPS 诱导急性炎症的作用，另一方面也提示番茄叶水提物对于不同的炎性细胞因子其作用强度可能存在差别。鉴于IL-1、IL-6 可由多种细胞合成，包括活化的T 细胞和B 细胞、单核-巨噬细胞、内皮细胞等，而TNF-α 则主要由单核-巨噬细胞产生，上述差异的产生是否缘于番茄叶水提物对不同细胞的作用的差别，需要更多的实验证据加以证实。

按改良寇氏法计算，本研究中番茄叶水提物单次灌胃给药的LD50为46.44 g/kg，其95%可信限为39.52～54.60 g/kg，而本研究所用的最高剂量仅为3.19g/kg，两者之间巨大的剂量差距表明，较小剂量的番茄叶水提物在发挥抑制LPS 诱导急性炎症的药理作用时仍然具有良好的安全性。然而，包括长期毒性研究在内的更多的安全性评价实验证据将能够提供对番茄叶水提物更合理的安全性评价结论。

1 Pan XF(潘雪峰)，Yuan F(袁锋). Qualitative analysis of essential of stem and leaf in tomatoes by GC-MS. J Northeast For Univ (东北林业大学学报)，2000，28:119-120.

2 Sun Y(孙莹)，Lu ZP(卢志平)，Gao SH(高松红)，et al.Extraction and identification of the volatile compositions from the stems and leaves of lycopersicon esculentum mill. Chin J Med Chem (中国药物化学杂志)，2001，11:277-278.

3 Feng JT(冯俊涛)，Shi YQ(石勇强)，Zhang X(张兴).Screening studies on fungistasis of 56 plant extracts. J Northwest Sci-Tech Univ of Agric Forest(西北农林科技大学学报)，2001，29(2):65-68.

4 Tao YX(陶永霞)，Liu HH(刘洪海)，Wang ZM(王忠民)，et al.Study prospect and outlook on tomatine.Mod Food Sci Tech(现代食品科技)，2006，22:253-256.

5 Ben-Haim S，Gacinovic S，Israel O. Cardiovascular infection and inflammation.Semin Nucl Med，2009，39:103-114.

6 Yuan H，Perry CN，Huang C，et al.LPS-induced autophagy is mediated by oxidative signaling in cardiomyocytes and is associated with cytoprotection. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296:470-479.

7 Yoon WJ，Moon JY，Kang JY，et al.Neolitsea sericea essential oil attenuates LPS-induced inflammation in RAW 264.7 macrophages by suppressing NF-kappaB and MAPK activation.Nat Prod Comm，2010，5:1311-1316.

8 Tucsek Z，Radnai B，Racz B，et al.Suppressing LPS-induced early signal transduction in macrophages by a polyphenol degradation product:a critical role of MKP-1.J Leukoc Biol，2011，89:105-111.