人血浆中头孢克肟的LC-MS/MS 法测定及生物等效性研究*

王雨萍，鲁卓林，尹永强，任晋民

(1.天津市儿童医院，天津 300014; 2.天津医科大学，天津 300070; 3. 河北医科大学第二医院，石家庄 050017)

头孢克肟为β -内酰胺类的抗生素，是第三代广谱口服头孢菌素，对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抗菌活性，临床上主要用于敏感菌所引起的肺炎、支气管炎、泌尿道炎、胆囊炎、胆管炎、中耳炎等疾病的治疗［1］。目前，常用的头孢克肟测定方法主要有高效液相色谱法［2，3］、化学发光法［4］等，但是存在灵敏度低、专属性差以及预处理操作烦琐费时等缺点。本文建立了人血浆样品中头孢克肟的LC -MS/MS 分析方法，该方法具有灵敏高、专属性好、准确的特点，预处理方法简便快速，尤其适宜高通量血浆样品头孢克肟含量的测定，并对头孢克肟分散片的人体内生物等效性进行评价。

1 仪器与试药

1.1 仪器 API 4000 型液相色谱- 三重四极杆质谱联用仪，配有ESI 源、Analyst 1.4.2 数据采集系统软件(美国ABI 公司)。Shimadzu 20A 液相色谱系统，包括二元梯度泵、在线脱气机、自动进样器和柱温箱(日本岛津公司)。AG-135 分析天平(瑞士MettLer ToLedo公司)。GZ - 20G - Ⅱ型离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 试药 对照品:头孢克肟(批号130503 -200904，以头孢克肟计含量为86.4%)和甲磺酸酚妥拉明(批号00110 -200602，纯度:99.9%)均购自中国药品生物制品检定所。受试制剂(A):头孢克肟分散片(规格50 mg/片，批号100101，华北制药秦皇岛有限公司);参比制剂(R):头孢克肟分散片(商品名世福素，规格100 mg/片，批号2100002，广州白云山制药总厂)。乙腈和甲酸为色谱纯，水为杭州娃哈哈集团有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱和质谱条件 色谱条件:XDB -C8柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，保护柱C18(4 mm×3.0 mm);流动相为乙腈- 水- 甲酸(40 ∶ 60 ∶ 0. 5);流速0. 6 ml/min;柱温20 ℃;进样量20 μl。

质谱条件:电喷雾离子化(ESI)源;喷雾电压5500 V;雾化温度600 ℃;雾化气45 L/min;帘气30 L/min;碰撞气8 L/min;辅助气50 L/min;检测方式:正离子多反应监测(MRM);监测离子m/z 454.3→285.2(头孢克肟)，m/z 282.2 →212.2(酚妥拉明)，碰撞诱导解离电压均为27 V;驻留时间100 ms。

2.2 标准溶液制备

2.2.1 对照品贮备液 精密称取对照品头孢克肟11.6 mg(相当于头孢克肟含量为10.0 mg)，转移入10 ml 量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得浓度为1.0 mg/ml的对照品贮备液。

2.2.2 对照品工作液 采用空白血浆将对照品贮备液分别稀释成浓度为0.05、0.10、0.30、1.00、3.00 和5.00 μg/ml 的系列标准溶液，即为对照品工作液。

2.2.3 内标工作溶液 浓度50.0 ng/ml 的甲磺酸酚妥拉明乙腈溶液。

2.3 血样预处理 取100 μl 血浆样品，并依次加入乙腈200 μl、内标溶液100 μl，涡流混合30 s，低温离心(11 000 r/min)5 min 后，转移上清液100 μl 至2 ml 离心试管中，然后加甲酸的水溶液(0.5%)200 μl，涡流混合30 s，离心后吸取200 μl 装入自动进样器小瓶，进样20 μl 进行含量分析，并记录主峰和内标峰面积，采用标准曲线法计算血样的头孢克肟浓度(g/ml)。

2.4 专属性试验及基质效应考查 专属性试验:头孢克肟和内标的一级全扫描质谱(ESI)主要生成准分子离子峰［M + H］+，质荷比分别为m/z 454. 3 和m/z 282.2。选择性对准分子离子峰进行二级质谱分析，用于定量分析时监测的产物离子为头孢克肟和内标酚妥拉明生成的主要碎片离子，分别为m/z 285.2 和m/z 212.2。分别取不同来源的6 名受试者的空白人血浆100 μl，并以甲醇代替内标溶液，按“2.3”项下方法操作;将适量头孢克肟标准溶液加入空白人血浆中制备成浓度为5.00 μg/ml 的血浆模拟样品，按同法操作;另取志愿受试者用药5 h 后的血浆样品100 μl，按同法操作。由血浆样品按本实验法分离测定所得的分析色谱图表明，空白样品中内源性物质不干扰头孢克肟的分析，通过与空白血样添加标准对照品(头孢克肟、酚妥拉明)色谱图比较，测得头孢克肟和内标酚妥拉明的保留时间约为2.7 和3.3 min。色谱图见图1。

在确立实验分析方法过程中，考查了基质效应，结果表明基质效应不显著，不影响头孢克肟和内标含量的准确测定。

2.5 标准曲线制备 取适量对照品工作液，以空白血浆稀释，分别制成浓度为5. 00、3. 00、1. 00、0. 30、0.10和0.05 μg/ml 的系列线性工作液，按“2.3”项下方法操作并进行分析测定。以头孢克肟浓度C 为横坐标，头孢克肟与内标峰的面积之比R 为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为R =0.456 C +1.1 ×10-4(r =0.999)。结果表明，头孢克肟在0.05 ～5.00 μg/ml 浓度范围内线性关系良好，最低定量限为0.05 μg/ml，准确度为8.1%，RSD 为3.8%(n=6)。

2.6 方法回收率及精密度试验 按“2.5”项下方法分别制备成低、中、高3 个浓度(0. 10、1. 00 和4. 00 μg/ml)的血浆模拟样品各6 份，共4 批次，然后分别进样测定，计算日内、日间RSD，方法回收率及精密度试验结果见表1。同法制备低、中、高浓度(0.10、1.00和4.00 μg/ml)的血浆模拟样品各6 份，分别测定头孢克肟的峰面积S1 与相应浓度头孢克肟溶液的峰面积S2，计算头孢克肟的提取回收率(按S1/S2 ×100%)，结果分别为94.5%、105.0 %和91.5% (n =6)。内标的提取回收率为101.0% (n=9)。

表1 方法回收率及精密度试验结果(n=6)

2.7 稳定性试验 考查浓度为0.10 和4.00 μg/ml的头孢克肟血浆样品分别在避光条件下室温放置4 h、样品处理后在室温放置24 h、冻融3 次和冻存30 d 的稳定性，结果表明头孢克肟峰面积的RSD 均小于6.6%(n =6)，提示血浆样品在上述条件下均保持稳定。

2.8 血药浓度分析和药动学研究

2.8.1 研究对象20 名男性健康志愿者，年龄(22.0 ±1.9)岁，体重(65.0 ±6.0)kg，身高(173 ±5)cm，试验前均经严格体检证实其心、肝、肾功能及血糖等指标正常，试验前2 周及试验期间未使用其他任何药物，且无烟酒不良嗜好。本试验方案经河北医科大学医学伦理委员会审核批准，所有志愿者全部签署书面知情同意书。

2.8.2 试验研究方案 采用随机分组、双交叉、两周期试验设计进行本项研究，20 名受试者随机分为两组，其中一组先口服受试制剂，于间隔期1 周后服用参比制剂;另一组首先口服参比制剂，于间隔期1 周后服用受试制剂。根据头孢克肟制剂的临床常用剂量，确定本次试验研究的给药剂量为100 mg(单剂量)。试验当日早晨，受试者空腹口服试验药物，饮用250 ml温开水送服受试制剂或参比制剂，2 h 内严格禁水，服药4 h 后各进食标准餐1 次。试验期间受试者保持日常轻微活动，不允许长时间卧床，并避免剧烈活动。同时受试者禁用其他药物及含咖啡因类成分的饮料，禁止吸烟、饮酒。

图1 头孢克肟及内标的MRM 色谱图

2.8.3 血样采集方法 在服药前取1 个空白血样，再于服药后0.75、1.5、2.25、3、4、5、7、9、11、13、15 和24 h 各个时刻采集12 个血样，血样采自上肢静脉血3 ml，注入肝素化管中，混匀后离心(转速3000 r/min)10 min，血样于-70 ℃冰箱保存待测。

2.8.4 数据分析处理 采用DAS 2.0 程序软件计算药代动力学参数(权重系数选择1)。数据处理方法:用逐个受试者的血药浓度-时间数据作曲线拟合，首先求得个体参数再计算平均值。Tmax、Cmax取实际测得值，消除半衰期按t1/2= -0.693/Zeta 计算，药时曲线下面积(AUC)由梯形法求得。Cmax及AUC 值经对数转换后进行双单侧t 检验、90%置信区间检验及方差分析，Tmax用非参数法分析，评价受试与参比制剂的生物等效性。20 名受试者口服单剂量受试制剂和参比制剂的药代动力学参数计算结果见表2，平均药时曲线参见图2。

表2 20 名受试者口服2 种头孢克肟制剂的主要药动学参数(n=20)

图2 20 名受试者口服2 种头孢克肟制剂后的平均药时曲线

3 讨论

头孢克肟常用测定方法主要是HPLC 法等，虽然HPLC 法检测灵敏度较好，但实现内源性物质与被分析物色谱分离比较困难，对样品前处理的要求高，如使用固相萃取作为样品提取手段［5］，预处理过程复杂、耗时;而使用高氯酸或三氯乙酸沉淀蛋白的预处理方法对色谱柱的损害较大。其他如化学发光法的方法特异性差，易受多种因素的干扰，不适用于生物样品的检测。本法建立了高灵敏的LC-MS/MS 法，最低定量浓度为0.05 μg/ml，在多反应检测模式(MRM)下，方法的专属性好，待测组分能达到有效分离，样品预处理方法采用乙腈沉淀蛋白，具有简便、快速的特点，适用于大批量血浆样品的头孢克肟含量测定。

本文两种头孢克肟分散片的主要药动学参数无显著差异，与文献报道［6］相似。生物等效性统计分析结果表明，受试制剂头孢克肟的AUC0-24h为94.7% ～109.1%，Cmax的90%置信区间89.3% ～105.3%。按照《中国药典》附则的生物等效性判断标准，受试制剂AUC 的90% 置信区间落在标准参比制剂的80% ～125%之间，Cmax落在75% ～133%之间即可认为等效，故判定受试制剂与参比制剂具有生物等效性。受试制剂的相对生物利用度为(103.2 ±18.0)%。

1 杜旭，冯涌，曹晓云.高效液相色谱法测定头孢克肟及其片剂和胶囊剂的含量和有关物质. 天津药学，2009，21(3):27

2 蔡爽，冯婉玉，李发美. HPLC 法测定人血浆中头孢克肟浓度［J］.沈阳药科大学学报，2004，15(8):286

3 沈健，周建国. 高效液相色谱法测定头孢克肟分散片的含量［J］. 中国药业，2008，17(14):43

4 何树华，何德勇. NBS-荧光素化学发光体系测定头孢吡肟和头孢克肟［J］. 四川师范大学学报，2008，31(3):350

5 刘松青，代青，马文秀，等. 固相萃取法用于生物样品中头孢克肟浓度测定的样品准备［J］. 第三军医大学学报，2001，23(9):1088

6 林建阳，阚周密，冯婉玉. 头孢克肟胶囊的药物动力学及生物等效性研究［J］.中国医药工业杂志，2006，37 (7):480