天仙子中消旋山莨菪碱、东莨菪碱和阿托品的含量测定及HPLC 特征图谱研究*

周 军，赵 晨，张 洋，曲 佳，吕曙华

(1.天津市药品检验所，天津 300070; 2.天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂，天津 300457 )

天仙子是茄科植物莨菪Hyoscyamus niger L 的干燥成熟种子，为2005 年版《中国药典》一部［1］收载的药材，化学成分主要有生物碱、甾体化合物、脂肪油等，具有解痉止痛，安神定喘的功效。消旋山莨菪碱、东莨菪碱及阿托品是天仙子生物碱类物质中的主要成分，既是有效成分，又是有毒成分。有文献报道对天仙子中上述生物碱类成分进行含量测定，但因为提取方法烦琐和色谱条件重现性较差，其含量测定方法未能载入药典标准中。为完成《中国药典》修订任务，本文建立上述三种成分的含量测定方法;实验中同时对天仙子的特征图谱进行了初步研究，为《中国药典》中该品种药材含量测定和质量控制提供了数据和借鉴。

1 仪器与试药

Agilent 1200 高效液相色谱仪，配有在线脱气机、四元泵、VWD 检测器、自动进样器、ChemStations 色谱工作站。SIBATA 超声波清洗器。

消旋山莨菪碱对照品(批号100249 -199501)、氢溴酸东莨菪碱对照品(批号100049 -200308)和硫酸阿托品对照品(批号100040 -200510)均购自中国药品生物制品检定所，含量测定用。乙腈、四氢呋喃(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)，水为去离子水，醋酸钠、冰醋酸、三乙胺(分析纯，天津市康科德科技有限公司)。试验用药材来自不同产地，均由天津药检所中药室吴贵华副主任药师鉴定为天仙子。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为资生堂CAPCELL - PAK C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);乙腈-甲醇-醋酸钠缓冲液(5 ∶ 5 ∶ 90)为流动相〔醋酸钠缓冲液(含30 mmol/L 醋酸钠，0.02%三乙胺，0.3%四氢呋喃，用冰醋酸调pH 6.0)〕;流速1.0 ml/min;检测波长为210 nm;柱温:30 ℃;进样量5 μl。在此色谱条件下，精密吸取对照品溶液、供试品溶液进样，测定。结果消旋山莨菪碱、东莨菪碱和阿托品的保留时间分别为13.4、17.0、24.8 和30.8 min;分离度均大于1.5;色谱图见图1;理论板数按莨菪碱峰计算应不低于10 000;样品中其他成分对消旋山莨菪碱、东莨菪碱、阿托品的测定无干扰。

2.2 对照品溶液的制备 取消旋山莨菪碱、氢溴酸东莨菪碱(60 ℃干燥1 h 后在105 ℃干燥3 h)、硫酸阿托品对照品(120 ℃干燥3 h)各适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml 分别含0.15、0.04 和0.1 mg 的混合溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取天仙子药材适量，研细，精密称取细粉2 g，置索氏提取器中，加石油醚(30 ～60℃)适量，加热回流2 h，弃去石油醚液，药渣挥干石油醚，置索氏提取器中，加甲醇适量，加热回流6 h，提取液减压回收至近干，残渣加稀氨水溶液(氨试液5 ml→25 ml)25 ml 使溶解(可用少量三氯甲烷洗涤容器及残渣)，用三氯甲烷提取5 次，每次15 ml，合并三氯甲烷液，减压回收至干，残渣加无水乙醇使溶解，转移至10 ml 量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

图1 对照品(A)样品(B)HPLC 色谱图

2.4 线性关系的考查 取消旋山莨菪碱、氢溴酸东莨菪碱和硫酸阿托品对照品各适量，精密称定，加甲醇制成消旋山莨菪碱、东莨菪碱和硫酸阿托品浓度为0.2338，1.3657 和1.6812 mg/ml 的混合对照品溶液，分别精密吸取0.2、0.5、1、2.5、5 和10 ml，置25 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，分别精密量取5 μl，进样分析，以相应质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。消旋山莨菪碱、东莨菪碱和阿托品回归方程分别为:Y= -6.1215 +1458.5 X (r=0.9999)、Y=7.5651 +1121. 9 X (r =0. 9999)和Y = -2. 2388 +1207.8 X (r=0.9999)，结果表明消旋山莨菪碱进样量在0. 009 35 ～0. 4676 μg、东莨菪碱在0. 054 63 ～2.7314 μg、阿托品在0.067 25 ～3.3623 μg 范围内与峰面积具有良好的线性关系(氢溴酸东莨菪碱折合成东莨菪碱系数为0.7894，硫酸阿托品折合成阿托品系数为0.8551)。

2.5 精密度试验 取供试品溶液连续进样6 次，记录峰面积，计算消旋山莨菪碱、东莨菪碱和阿托品峰面积的RSD 分别为3.50%、0.20%和0.20%。

2.6 重复性试验 取同一天仙子药材适量，研细，取2 g，共6 份，精密称定，制成供试品溶液进样，测定3 种成分含量，6 次测定值分别为:消旋山莨菪碱0.0321 mg/g，RSD 为2.67%;东莨菪碱0.5499 mg/g，RSD 为1.51%;阿托品0.6448 mg/g，RSD 为1.41%。

2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液分别在0、2、4、8、12、18 和24 h 进样，测定，结果消旋山莨菪碱、东莨菪碱和阿托品峰面积的RSD 分别为2.43%、0.16%和0.22%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.8 回收率试验 取消旋山莨菪碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为含消旋山莨菪碱0. 005 61 mg/ml、氢溴酸东莨菪碱0. 144 mg/ml、硫酸阿托品0.1528 mg/ml 的混合对照品溶液;精密量取混合对照品溶液5 ml 置圆底烧瓶中，减压蒸干。取同一天仙子样品适量，研细，精密称取1 g，置索氏提取器中，用上述圆底烧瓶按照“2.3”项下供试品溶液制备操作，制得供回收率用供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，计算回收率，结果山莨菪碱平均回收率为103.72%，RSD 为1.72%;东莨菪碱平均回收率为98.57%，RSD为1.64%;阿托品平均回收率为102. 96%，RSD 为1.26%。

2.9 样品的测定 取8 个不同产地的天仙子药材，按照供试品溶液制备操作，在上述色谱条件下进样测定，记录峰面积，按外标法计算含量。结果见表1。

3 天仙子药材特征图谱的建立

3.1 稳定性试验 精密称取天仙子粉末2 g，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件，分别在0、2、4、8、12、18 和24 h 进样10 μl，记录色谱图，结果表明，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 均在2.4%以内，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

表1 不同产地天仙子药材中3 种生物碱的测定结果(n=2)

3.2 精密度试验 精密称取天仙子粉末2 g，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件，连续进样6 次，记录色谱图，考查各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果表明，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 均在2.0%以内，表明该方法精密度良好。

3.3 重复性试验 精密称取同一天仙子粉末6 份，各2 g，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件，进样测定，记录色谱图，考查各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果表明，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 均在1.7%以内，表明该方法重复性良好。

3.4 特征图谱共有峰的确定 分别取不同产地的天仙子样品8 批，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件下各取10 μl，进样，得到8 批样品的HPLC 色谱图，分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)”，选定5 号峰为marker峰，进行谱峰匹配(匹配后的色谱图见图2)，通过相似度计算得出天仙子药材特征图谱的共有模式，得到特征图谱(见图3)。8 批天仙子药材的相似度依次为1.000、0. 974、0. 972、0. 999、1. 000、1. 000、0. 993 和0.982，表明8 批药材具有较高的相似度。

图2 8 批样品匹配后的HPLC 色谱图

图3 天仙子HPLC 特征图谱

4 讨论

4.1 提取方法的优化 文献报道［2-4］中天仙子的含量测定方法较烦琐，提取步骤均为提取液反复碱化→酸化→三氯甲烷提取，导致无法准确定量，且三氯甲烷用量较大。经大量实验，本文采用石油醚脱脂→甲醇提取→用氨水碱化→三氯甲烷提取的方法，大大简化提取过程，减少溶剂用量和提取时间。因天仙子为种子类药材，含有大量的油脂类成分，对提取及分离具有非常大的影响，故石油醚脱脂为本实验中关键的步骤。

4.2 流动相的选择 实验中对文献报道的流动相逐一进行试验，结果发现对照品及供试品中消旋山莨菪碱、东莨菪碱及阿托品均存在峰形较差的现象，表现为色谱峰不对称、拖尾或不能有效分离上述三种成分。经试验，本文采用乙腈-甲醇-醋酸钠缓冲液(5∶ 5∶90)为流动相，供试品色谱中消旋山莨菪碱、东莨菪碱、阿托品色谱峰与杂质峰分离较好，分离度均大于1.5;采用三种不同牌子色谱柱(DIKMA，Phenomenex，CAPCELL)耐用性均较好。

4.3 流动相的优化 取不同浓度(10、20、30 和40 mmol/L)的醋酸钠缓冲液，进样，测定，结果以缓冲盐浓度为30 mmol/L 时效果较好;取浓度为30 mmol/L的缓冲液，分别用冰醋酸调节pH 值为5.0、5.5、6.0、6.5 和7.0，进样，测定，结果以pH 值为6.0 时效果较好;对流动相中乙腈和甲醇的比例进行考查，确定乙腈-甲醇-醋酸钠缓冲液比例为(5∶ 5∶ 90);在流动相中添加三乙胺和四氢呋喃后可有效的改善拖尾和调节峰形。

4.4 柱温的选择 比较不同柱温(30、35 和40 ℃)条件下样品的分离情况，结果以柱温为30 ℃样品分离较好。

4.5 峰纯度检查 取对照品溶液和供试品溶液，使用二极管阵列检测器，在上述色谱条件下进样测定。结果样品色谱中消旋山莨菪碱、东莨菪碱、阿托品色谱峰均为纯色谱峰。

4.6 不同色谱柱对含量测定的影响 取重现性试验项下的供试品溶液，分别采用资生堂CAPCELL -PAK C18柱，phenomenex C18柱，DIKMA - Kromasil C18柱，均为(4.6 mm×250 mm，5 μm)，采用Agilent-1200 高效液相色谱仪，进样，测定，计算样品中山莨菪碱、东莨菪碱及阿托品的总量。结果上述3 种色谱柱测定结果基本一致，说明不同色谱柱对样品的含量测定结果无明显影响。

4.7 从收集的8 个产地药材测定结果分析，天仙子药材中消旋山莨菪碱的量较低，平均为0.018%，约占生物碱总量(1. 05%)的1. 7%;东莨菪碱的量平均为0.43%，约占生物碱总量(1.05%)的41%;阿托品的量平均为0.61%，约占生物碱总量(1.05%)的58%。各地药材中总生物碱含量为0.8437 ～1.2701%，基本在平均含量(1.05%)的80% ～120%范围内。本含量测定方法已被《中国药典》2010 年版收录，因消旋山莨菪碱量所占总生物碱比例较低，约为1.9%，因此未将其列入质量标准正文。

4.8 特征图谱 本实验采用RP -HPLC 法对天仙子进行分析，由生成的特征图谱可以看出不同产地的天仙子药材特征图谱中主要色谱峰的整体图貌基本一致，均具有相同的色谱特征峰。利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A，2004B)”可以很好的对天仙子药材特征图谱进行相似度评价，对鉴别药材的真伪优劣有重要的参考价值。

1 中国药典［S］.一部.2005:37

2 马翠英，陈德昌，杨兆起. 反相离子对HPLC 法测定天仙子中的生物碱及TLC 法鉴别天仙子和南天仙子［J］. 药物分析杂志，1996，16(2):119

3 王环，潘莉，张晓峰.HPLC 法测定天仙子和马尿泡中3 种托烷类生物碱的含量［J］.西北药学杂志，2002，17(1):9

4 邢桂菊，尹松鹤.高效液相色谱法测定天仙子中莨菪碱及东莨菪碱的含量［J］.中国医院药学杂志，2006，26(2):236