Neuregulin-1β 对压力超负荷心肌肥大大鼠治疗作用及机制的研究

刘延峰， 刘小娟， 惠起源△

(1延安大学医学院，2延安市卫生学校，陕西 延安716000)

心肌肥大(myocardial hypertrophy)是心肌细胞对持续负荷增加的一种适应性反应。高血压性心肌肥大是充血性心力衰竭重要的诱因及独立危险因子，初期具有一定的代偿意义，但在体循环高负荷长期存在时，心肌会发生失代偿，最终可导致心力衰竭。神经调节蛋白1β(neuregulin-1β，NRG-1β)是一种调节和保护性生长因子，因其首先在神经科学领域发现而得名。在成年心脏中，NRG-1β 特异性地在心肌内皮细胞中表达，心肌细胞并不表达NRG-1β;而其受体ErbB2 在心肌细胞中却有表达［1-2］。因此，靠近心肌细胞的内皮细胞合成并释放NRG-1β，通过旁分泌作用于心肌细胞中的受体。近年来的研究发现，NRG-1β/ErbBs 信号系统不仅参与心肌细胞和心脏胚胎发育的分化调控，与成体心脏功能、心衰的发生、发展乃致预后等病理过程也密切相关。本研究以腹主动脉缩窄导致压力超负荷心肌肥大大鼠为对象，通过外源性给予NRG-1β，观察NRG-1β 对压力超负荷心肌肥大大鼠心肌AngII 和TNF-α 表达的影响，以及NRG-1β 对bcl-2 和bax 表达水平的影响，探讨在体条件下NRG-1β 对压力超负荷心肌肥大大鼠的治疗作用及相关机制。

材 料 和 方 法

1 动物

雄性Wistar 大鼠48 只，体重220 ～280 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

2 材料

NRG-1β 购于以色列的Prospec-Tany Techno-Gene Ltd。ErbB2 受体拮抗剂赫赛汀(herceptin，HERCE)购自武汉日升科技发展有限公司。

3 方法

3.1 压力超负荷大鼠模型的建立 成年健康雄性Wistar 大鼠，体重为220 ～280 g，随机分为4 组，每组12 只。(1)腹主动脉缩窄(model)组:戊巴比妥钠(15 mg/kg)腹腔注射麻醉后，于左肾动脉上方小心分离约3 mm 长的腹主动脉，套以内径为0.8 mm 银夹缩窄腹主动脉，术后常规饲养。(2)假手术(sham)组:除不以银夹缩窄腹主动脉外，其余操作同腹主动脉缩窄组。(3)NRG-1β 干预组:腹主动脉缩窄术后8 周给予NRG-1β 尾静脉注射，10 μg·kg-1·d-1，共7 d。(4)NRG-1β +HERCE 干预组:大鼠除相同方法注射NRG-1β 外，尾静脉注射ErbB2 受体拮抗剂HERCE 10 μg·kg-1·d-1，共7 d。假手术组和腹主动脉缩窄组给予同等剂量的生理盐水，尾静脉注射，共7 d。给药期间常规饲养。给药结束后，测量各组动物体重及血压，并进行相应指标的测定。

3.2 超声心动图( echocardiography) 测定 戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉，用HP Sonos 2500 型多功能超声检查仪及7.5 MHz 相控阵探头(美国惠普公司)检测左室收缩末内径(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)、舒张末内径(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)等指标并计算出左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)和短轴缩短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。

3.3 血流动力学检测 麻醉同上，分离右侧颈动脉，将导管插入颈动脉送至主动脉，然后进一步将导管送入左心室。导管通过压力传感器与泰盟BL-420F 多导生理监护仪连接，记录左室收缩末压(left ventricular end-systolic pressure，LVESP)、左室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)及左室内压最大上升、下降速率(maximal rate of increase/decrease in left ventricular pressure，± dp/dtmax)等指标。

3.4 心肌肥大指数的测定 各组动物摘取心脏。测量全心重、左心室重(包括左心室游离壁和室间膈)，计算心室重与体重比值(V/Bwt，Hermann Wilson’s 公式)作为心肌肥大指数。

3.5 左心室肌组织血管紧张素II(angiotensin II，Ang II)含量测定 取左心室肌组织约500 mg，剪碎，加入3 mL 0.1 mol/L 醋酸置于玻璃匀浆器制备组织匀浆，上述操作均在冰浴中进行。心肌匀浆10 000 ×g 离心20 min，上清液以放射免疫法(放射免疫试剂盒由北京北方生物技术研究所提供)测定Ang II 含量。

3.6 左心室肌组织肿瘤坏死因子α ( tumor necrosis factor α，TNF-α) 含量的测定 取左心室肌组织约500 mg，剪碎，加入3 mL 冰冻生理盐水于玻璃匀浆器制备组织匀浆，13 000 ×g 离心10 min。取上清液以酶联免疫吸附法(酶联免疫试剂盒北京北方生物技术研究所提供)测定TNF-α 含量。

3.7 Masson 胶原特殊染色及胶原容积分数( collagen volume fraction，CVF) 的测定 常规石蜡切片脱蜡，采用Masson 染色，逐级乙醇脱水，中性树脂包埋，镜下观察并摄片。采用图像分析系统测量CVF，CVF=胶原面积/总面积，每张切片均随机取3 个视野测量，计算其均值。

3.8 RT-PCR 法测定bcl-2 和bax mRNA 表达的变化 Trizol 法提取心肌组织中的总RNA，测定总RNA纯度，参照反转录试剂盒(Fermentas)说明书，取2 μg总RNA 样本在10 μL 体系中进行逆转录反应。取cDNA 2.5 μL 参照说明书(大连宝生物工程有限公司)在25 μL 体系中扩增。引物序列为:bcl-2 (NM-016787):上游引物5’-CGGGAGATCGTGATGAAGT-3’，下游引物5’-CCACCGAACTCAAAGAAGG-3’;bax(NM-017059):上游引物5’-GCAGGGAGGATGGCTGGGGAGA-3’，下游引物5’-TCCAGACAAGCAGCCGCTCACG-3’;GAPDH(NM-017008):上游引物5’-GTGCTGAGTATGTCGTGGAG-3’，下游引 物5’-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3’。以上引物由北京奥科生物公司提供。反应条件为:95 ℃30 s、55℃30 s、72 ℃1 min，共循环35 次，72 ℃8 min。PCR产物最好于24 h 内进行电泳。1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳后将凝胶置于凝胶成像系统中成像并计算条带中荧光的强度。基因的表达程度由样本中的PCR 产物条带的荧光程度与同一样本中GAPDH 的PCR 产物条带的荧光强度相比较而得出。

4 统计学处理

采用SPSS 13.0 统计软件，计量数据用均数±标准差(mean ± SD)表示，组间比较用单因素方差分析，两两比较用SNK 法。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 动物模型的建立

各组大鼠实验终点进行血压的测定，sham 组为(116.72 ±6.71)mmHg，model 组为(178.24 ±9.22)mmHg，NRG-1β 组为(133.04 ±12.13)mmHg，NRG-1β+ HERCE 组为(167. 31 ±11. 24)mmHg，其中，model 组血压较sham 组明显升高(P ＜0.01);V/Bwt的测定中，model 组(2.89 ±0.34)较sham 组(2.04 ±0.07)明显升高(P ＜0.01)，以上结果说明造模成功。NRG-1β 组血压及V/Bwt 较model 组显著下降(P ＜0.01)，而NRG-1β + HERCE 的干预逆转了这种改变，使血压维持在高水平。

2 超声心动图指标的比较

与sham 组相比，model 组的LVEF 和LVFS 明显降低(P ＜0.01)，而LVEDD 和LVESD 明显增大(P ＜0.01);与model 组相比，NRG-1β 组的LVEF和LVFS 明显升高(P ＜0.01)，LVEDD 和LVESD 明显下降(P ＜0.01);而NRG-1β + HERCE 组大鼠与sham 组及NRG-1β 组相比，LVEF 和LVFS 降低(P ＜0.01，P ＜0.05)，LVESD 和LVEDD 增高(P ＜0.01)，与model 组相比无明显变化，见图1。

3 血流动力学指标的比较

与sham 组相比，model 组的±dp/dtmax和LVESP明显降低(P ＜0.01)，LVEDP 明显升高(P ＜0.01);与model 组相比，NRG-1β 组±dp/dtmax和LVESP 明显升高(P ＜0.01)，LVEDP 明显降低(P ＜0.05);而NRG-1β+HERCE 组与sham 组及NRG-1β 组相比，±dp/dtmax和LVESP 明显降低(P ＜0.05，P ＜0.01)，LVEDP 明显升高(P ＜0.05，P ＜0.01)，与model 组无明显差异，见图2。

Figure 1. The values of LVESD，LVEDD，LVEF and LVFS in the four groups. A:the changes of LVESD and LVEDD;B:the changes of LVEF and LVFS.Mean±SD.n=6. ＊＊P ＜0.01 vs sham;##P ＜0.01 vs model;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs NRG-1β.图1 各组大鼠LVESD、LVEDD、LVEF 和LVFS 的变化

Figure 2. The values of LVESP，LVEDP and ±dp/dtmax in the four groups. A:the changes of LVESP and LVEDP;B:the changes of±dp/dtmax.Mean±SD.n=6. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham;# P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model;△P ＜0.05 vs NRG-1β.图2 各组大鼠LVESP、LVEDP 和±dp/dtmax的变化

4 术后各组心肌Ang II 和TNF-α 的变化

如图3 所示，与sham 组相比，model 组的Ang II和TNF-α 均明显升高(P ＜0. 01);NRG-1β 组较model 组的Ang II 和TNF-α 均显著降低(P ＜0.01)，而NRG-1β+HERCE 组较sham 组及NRG-1β 组Ang II 和TNF-α 均升高(P ＜0.01)。

Figure 3. The concentrations of Ang II and TNF-α in myocardium in the four groups. Mean ±SD. n =6. ＊＊P ＜0.01 vs sham;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs NRG-1β.图3 各组大鼠心肌Ang II 和TNF-α 的变化

5 心肌组织胶原含量及心肌胶原容积分数的变化

光镜下胶原纤维呈蓝色，心肌细胞胞质呈红色。正常大鼠心肌血管周围、细胞之间有少量的胶原纤维存在，形似蜂窝。Model 组心肌胶原纤维含量较sham 组明显增加(P ＜0.01)，分布弥散，排列紊乱。NRG-1β 组CVF 较model 组显著下降(P ＜0.01)，而NRG-1β+HERCE 组CVF 较sham 组及NRG-1β 组均升高(P ＜0.01，P ＜0.05 )，见图4。

6 各组bcl-2 和bax mRNA 表达的变化

如图5 所示，与sham 组相比，model 组大鼠心肌中bcl-2 mRNA 表达明显下降(P ＜0.01)，而bax mRNA表达增高(P ＜0.01);NRG-1β 组较model 组的Bcl-2 mRNA 表达显著升高(P ＜0.01)，而Bax mRNA 表达下降(P ＜0.01);NRG-1β +HERCE 组与sham 组及NRG-1β 组比较，大鼠心肌中Bcl-2 mRNA 表达显著下降(P ＜0.05)，Bax mRNA 表达增高(P ＜0.01)。

Figure 4. Fibrotic infiltration in myocardium (Masson’s trichrome staining，× 400). Red color shows cardiac myocytes and blue color shows collagen.Mean±SD.n=6. ＊＊P ＜0.01 vs sham;##P ＜0.01 vs model;△△P＜0.01 vs NRG-1β.图4 Masson 染色法测定心肌胶原含量

Figure 5. Expression of bal-2 and bax mRNA in myocardium detected by RT-PCR. Mean ±SD. n =6. ＊＊P ＜0.01 vs sham;##P ＜0.01 vs model;△P ＜0.05;△△P ＜0.01 vs NRG-1β.图5 RT-PCR 法检测心肌组织中Bal-2 和Bax mRNA 的表达水平

讨 论

心肌肥大是多种心血管疾病发展到一定阶段的病理过程［4］。心肌肥大的早期因心室壁增厚，心肌收缩功能改善而被视为代偿性过程。但是，在持久病理性应激情况下，心肌肥大伴随着间质纤维化、收缩功能失调以及基因表达、能量代谢和电生理特征的异常，最终导致了失代偿性的心功能衰竭。多种因素可刺激心肌肥大的产生，如容量及压力负荷的加大、氧化应激、机械牵拉及炎症等［3］。本研究通过腹主动脉缩窄术制备大鼠压力超负荷性心肌肥大模型，探讨NRG-1β 对持续压力超负荷所致心肌肥大的治疗作用及机制。

NRG-1 由1 400 kb 的基因编码，其通过几种启动子和选择性剪切能表达出3 种不同的NRG-1 蛋白亚型［5］，其中Ⅰ型是心脏中最重要的类型。研究发现［6］，在糖尿病心肌病中，NRG-1β 表达显著下调，参与了糖尿病心肌病的发生和发展。另外，NRG-1β 能降低糖尿病大鼠心肌间质纤维化及细胞凋亡，这些作用与其上调Bcl-2、下调Bax 和caspase-3 表达有关［7］。NRG-1 通过ErbB2、ErbB3 和ErbB4 这3 种受体在心脏发育过程中起作用。大量研究表明，NRG-1β/ ErbBs 信号系统在很多方面起着重要的调节作用，如促进培养新生大鼠心肌细胞肌节结构的正常化，通过细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)在心肌肥大中调节肌小节的合成和排列［8］。NRG-1β 基因条件性敲除小鼠表现为扩张型心肌病［9］，而ErbB2 基因敲除小鼠也表现为心室壁变薄、心室腔扩张、收缩力下降等扩张型心肌病的病理变化［10］。研究显示［11］用阿霉素诱导培养的成年大鼠心肌细胞，细胞肌丝排列紊乱，用NRG-1(10 μg/L)孵育后，排列紊乱显著减轻，研究证明是由于激活了成年大鼠心肌细胞的ErbB2受体。因此，NRG-1β/ErbBs 信号系统成为心血管疾病的一个重要的潜在治疗靶点。

本实验采用腹主动脉缩窄法制备压力超负荷大鼠心肌肥大模型。与假手术组相比，模型组的血压、LVEDD 和LVESD 明显增大，LVEF 和LVFS 明显降低，提示模型制备成功。外源性给予NRG-1β 治疗后，大鼠的血压、LVEDD 和LVESD 明显减小，LVEF和LVFS 明显升高。 ±dp/dtmax是反映左室收缩、舒张功能的主要指标，本研究中，NRG-1β 组的±dp/dtmax较模型组明显升高，LVEDP 降低，表明NRG-1β静脉注射能改善心脏功能。采用Masson 法观察大鼠心肌胶原的变化，模型组CVF 明显升高，而NRG-1β 的干预逆转了这一变化。以上结果提示，应用NRG-1β 后，血流动力学得到了改善，心肌胶原分泌减少，进而提高了整体心肌肥大大鼠的心功能。作为NRG-1β 受体ErbB2 的阻断剂，HERCE 在本实验中被用于进一步观察NRG-1β 的作用，结果显示，HERCE 干预后，NRG-1β 改善心肌功能的作用消失，以上各指标与模型组相比均无明显变化。提示，NRG-1β 通过它的受体ErbB2 在心肌肥大中发挥着重要作用。

NRG-1β 的合成与表达受许多神经-体液因素影响。对NRG-1β 处理的成年大鼠心室肌细胞的研究发现，NRG-1β 能通过磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B，Akt)通路，激活内皮一氧化氮合酶(endothelialnitric oxide synthase，eNOS)，增加一氧化氮(nitric oxide，NO)的产生，激活蛋白激酶G(protein kinase G，PKG)，促使受磷蛋白磷酸化，提高肌浆网钙泵的活性，增强舒张期肌浆网钙的回摄，从而改善心肌收缩和舒张功能［12］。在糖尿病心肌病中，NRG-1β表达显著下调，同时心脏内皮素-1 的表达、氧化应激及活性氧产物增加［13］，这些因素可提高内皮细胞NRG-1 的表达［14］。另外，高糖引起的去甲肾上腺素和Ang II 分泌增多，又可抑制NRG-1β 的表达。在慢性心衰进展的不同阶段，AngII 和肾上腺素的改变也可导致心脏NRG-1β/ErbBs 系统发生不同变化。这些证据表明，NRG-1β 的作用与体内的众多体液因素的调节有关。心肌肥大的具体机制虽未明确，但细胞因子的增多及炎症细胞的浸润在心肌肥大中的作用已确立，其中Ang II 及其相关的多条信号通路发挥着关键作用。研究显示，心肌内源性TNF-α 在慢性压力超负荷性心肌肥大的发生发展中起着重要的调控作用，而肾素-血管紧张素系统激活是心肌中TNF-α 表达上调的重要调控因素。本实验结果显示，与假手术组相比，模型组的Ang II 及TNF-α 明显增高，NRG-1β 抑制了这一反应，而HERCE 的使用逆转了NRG-1β 的抑制作用，提示NRG-1β 与其受体相互作用，可降低压力超负荷大鼠心肌中Ang II 及TNF-α 的过表达，进而减轻由Ang II 及TNF-α 诱导的心肌间质重构，从而在心肌肥大过程中发挥改善心肌功能的作用。

NRG-1 可通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/ERK、PI3K/Akt、Src/黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)、NO 合酶(NO synthase)等多种信号通路发挥作用，参与细胞分化、增殖与凋亡调节［15-16］。于水等［8］用硫化氢处理缺血/再灌注离体心脏，能明显减轻心肌收缩和舒张功能障碍，而PI3K/Akt 信号通路参与了硫化氢处理的心肌保护。有报道提出，Akt 诱导的Bcl-2 家族表达变化可能参与NRG-1β 的心肌保护机制。本研究证实，NRG-1β 可增加心肌肥大组Bcl-2 的表达，而Bax 的表达降低。Bcl-2 位于线粒体膜，可促进细胞生存，抑制细胞凋亡。进而改善肥大心肌的心功能。

综上所述，本研究结果提示，NRG-1β/ErbBs 信号系统在压力超负荷型心肌肥大中发挥着重要作用，外源性给予NRG-1β 能降低压力超负荷心肌肥大大鼠心肌中Ang II 及TNF-α 的过表达，进而减轻了由Ang II 及TNF-α 介导的心肌重构;NRG-1β 诱导肥大心肌bcl-2 mRNA 的表达增加，bax mRNA 的表达减少，从而抑制心肌细胞凋亡，减轻纤维化，改善心肌功能。这为心肌肥大的治疗提供了新的思路。

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