一种新型蛋白类药物口服载体的海藻酸钠/巯基化果糖-壳聚糖复合水凝胶

张银叶， 代苗苗， 邱叶艳， 杜 艳， 何所惧， 龚仁敏

(安徽师范大学生命科学学院， 芜湖 241022)

近年来，蛋白质类药物非注射给药途径已成为药剂学研究的一个热点，这些途径包括眼部、鼻腔、肺部、直肠、口腔黏膜、口服给药等，其中口服给药是最便捷且最易被患者接受的给药方式，然而口服给药过程中存在的酶屏障、生理屏障、制药工艺屏障等均可导致蛋白质类药物的生物利用率降低[1-3]。各种口服蛋白质类药物载体被用来改善这类药物的生物利用率，其中物理交联等方法制备的高分子水凝胶微球，对外界环境变化可作出敏感的应答，可改善蛋白质、多肽在体内易变性降解的性质，在药物控、缓释等方面具有很好的应用前景[4-7]。

壳聚糖(Chitosan，CS)是一类由D-氨基葡萄糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖组成的碱性多糖，具有天然无毒、生物相容性好及可降解等特性[8]，已经广泛应用于医药领域[9-11]。但是仅在酸性介质中溶解的性质影响了壳聚糖的用途，目前研究人员通过化学改性来提高其溶解性[12]。 海藻酸钠(Sodium Alginate，Alg)是一种由甘露糖醛酸(Mannuronic acid，M)与其立体异构体古洛糖醛酸(Guluronic acid，G)通过α-(1,4)糖苷键链接而成的亲水性多糖，具有良好的可降解性和生物相容性[13]和凝胶作用，在医药工程、新型药物载体、基因治疗[14-15]等领域有广泛应用。

本研究以果糖修饰壳聚糖改善其水溶性，再经半胱氨酸修饰成为巯基化果糖-壳聚糖，以增加其肠壁粘附性[16]。海藻酸钠与巯基化果糖-壳聚糖混合后，以氯化钙和硫酸钠双重交联制得复合水凝胶珠，研究了水凝胶珠的溶胀性质。以牛血清白蛋白(BSA)为模式蛋白进行了药物包载和释放的研究，以考察海藻酸钠/巯基化果糖-壳聚糖复合水凝胶作为蛋白类药物口服载体的可行性。

1 试剂与仪器

1.1 试剂

壳聚糖(CS，脱乙酰度>95.0%，日本兴洋化工有限公司)，D-果糖(上海惠兴生化试剂有限公司)，硼氢化钠(中国国药集团化学试剂有限公司)，半胱氨酸(Cys，上海博舜生物科技有限公司)，二环己基碳二亚胺(DCC，SCIENTIFIC)。4-二甲氨基吡啶(DMAP，购自美国sigma公司)，二甲亚砜(DMSO，无锡市亚盛化工有限公司)，海藻酸钠(Alg，购自美国sigma公司)，透析袋MD36(截留分子量12000，美国联合碳化公司)，牛血清蛋白(BSA，购自美国Sigma公司)，其它试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器

电子分析天平(上海精科实业有限公司)，数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限公司)，增力电动搅拌机(JJ-2型，金坛市医疗仪器厂)，恒温磁力搅拌器(79HW-1型，江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂)，UV-Vis分光光度计(754—PC型，上海菁华科技仪器有限公司)，冷冻干燥机(美国LABCONCO公司)，傅立叶变换红外光谱仪(Nexus 870 FT-IR型), 扫描电子显微镜(JSW-6390LV 日本电子)。

2 方法

2.1 果糖-壳聚糖的制备及溶解性的测定

在酸性条件下，果糖的羰基与壳聚糖的氨基脱水形成Schiff碱。RH-C=O+CS-NH2→RH-C= N-CS

称取4.5 g CS溶于100 mL 1%(V/V)的乙酸，加入8.879 g果糖，37 ℃条件下搅拌反应4～5 h后，加入硼氢化钠还原24 h，用95%乙醇终止反应，将析出产物用无水乙醇、乙醚洗涤3～4次，抽滤，烘干，得到果糖-壳聚糖。称取5 g壳聚糖或果糖-壳聚糖溶于50 mL蒸馏水，在37 ℃条件下缓慢振荡，每隔2 h抽滤、烘干，称重，分别测其溶解性。

2.2 巯基化果糖-壳聚糖(TFC)的制备及巯基测定

制备过程参照文献[17]。称取0.25 g Cys溶于50 mL DMSO，依次加入0.426 g DCC、0.194 g DMAP、1 g果糖-壳聚糖，常温反应24 h，将反应产物透析3次，每次2 d，最后用乙醚洗涤过滤，冷冻干燥，获得TFC。

用直接碘量法(2SH-+I2+3O2==HSO3+2I-)测定巯基含量：称取0.2 g TFC，溶于50 mL蒸馏水，加入5 g/L淀粉指示剂1 mL后，立即用0.005 mol/L I2标准溶液滴定至浅蓝色，计算出每克TFC中的巯基含量：

巯基含量(mmol/g) =2(CV)/W0

其中，C为I2的浓度，单位 mol/L; V为滴定消耗I2标准溶液的体积，单位mL；W0是巯基化果糖-壳聚糖的质量，单位g。

2.3 TFC的红外光谱的测定

用傅立叶红外光谱仪对TFC进行红外测试，采用KBr压片法。

2.4 Alg/TFC复合水凝胶的制备及溶胀实验

称取2.0 g Alg溶于100 mL蒸馏水，2.0 g TFC溶于100 mL 蒸馏水。按不同比例(Alg/TFC=9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5)将Alg溶液加入TFC溶液中均匀混合，用注射器将Alg/TFC混合溶液缓慢滴入2%(W/V) CaCl2溶液，形成光滑的球形水凝胶珠，水凝胶珠在CaCl2溶液中搅拌交联1 h，充分洗涤后再浸入2%(W/V) Na2SO4溶液中搅拌交联0.5 h，用蒸馏水淋洗，过滤，收集，室温干燥至恒重，制得Alg/TFC复合水凝胶珠。

称取一定量(WO)的Alg/TFC样品分别置于3种缓冲溶液中(pH值1.2模拟胃环境、pH值6.8模拟小肠环境及pH值7.4模拟结肠环境)，在37 ℃条件下缓慢振荡。特定时间间隔内分别取出凝胶珠样品，用滤纸吸去凝胶珠样品表面多余的水分，称重(Wt)。凝胶珠样品溶胀率S(t)的计算公式：

S(t) = (Wt-WO)/WO

其中，Wt与WO分别为凝胶珠样品的湿重和干重，单位：g。

2.5 Alg/TFC复合水凝胶珠红外光谱的测定

用傅立叶红外光谱仪对Alg、TFC和以Alg/TFC=7∶3比例的凝胶珠进行红外测试，采用KBr压片法。

2.6 Alg/TFC复合水凝胶珠形态结构的测定

取5种(Alg/TFC=9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5)不同比例样品，用扫描电子显微镜(SEM)对其表面和剖面结构进行观察，离子渐射仪处理样品。

2.7 Alg/TFC水凝胶对BSA的包载及BSA的释放实验

称取2.0 g Alg溶于100 mL蒸馏水，2.0 g TFC溶于100 mL 蒸馏水中。按不同比例(Alg/TFC=9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5)将Alg溶液加入TFC溶液中，同时加入0.4 g BSA均匀混合，用注射器将混合溶液缓慢滴入2%(W/V) CaCl2溶液，凝胶珠在CaCl2溶液中搅拌交联1 h，充分洗涤后再浸入2%(W/V) Na2SO4溶液中搅拌交联0.5 h，用蒸馏水淋洗，过滤，收集，室温干燥至恒重，制得载BSA的 Alg/TFC复合水凝胶珠。

称取0.2 g载BSA的凝胶珠样品，置于pH值7.4磷酸盐缓冲液，在室温条件下振荡24 h，将溶液离心后在280 nm处测定其吸光值，依据BSA标准曲线计算出溶液中BSA含量。按照下述公式计算包载率(LE)：

LE(%)=(凝胶珠中包载的BSA的总量/实验中使用的BSA的总量)×100%

称取0.2 g载BSA的凝胶珠样品加入20 mL的模拟胃液(SGF pH值1.2)、肠液(SIF pH值6.8)、结肠液(SCF pH值7.4)中，在37 ℃条件下缓慢振荡，在一定的时间间隔内取5 mL在波长280 nm处测定其吸光值，同时补充等量的模拟溶液。BSA的累计释放量通过标准曲线计算获得，进行3次重复实验。

图1 壳聚糖和果糖壳聚糖的溶解性

3 结果与讨论

3.1 溶解性的测定结果及分析

实验结果如图1所示，10 h后达到溶解平衡，壳聚糖的溶解性只有6%左右，而果糖-壳聚糖的溶解性高达76%左右，是壳聚糖的12倍，由此可见改性的果糖-壳聚糖的溶解性提高。这主要是因为壳聚糖引入了含有亲水性基团的果糖，同时破坏了壳聚糖分子间的氢键作用，从而提高了其溶解性。

3.2 TFC中巯基的测定结果及TFC的红外光谱分析

巯基含量测定，重复实验3次，取其平均值，得巯基含量为0.95 mmol/g。TFC红外光谱测定结果如图2所示，在1700 cm-1～1750 cm-1处出现一个较强吸收峰，说明TFC中含有酯键。另外，在2400 cm-1～2500 cm-1附近，TFC(b)曲线与CS(a) 曲线相比有微弱的吸收峰，此峰为巯基的特征吸收峰。以上结果说明TFC已成功合成。

图2 CS (a)和TFC (b)的红外光谱

3.3 Alg/TFC复合水凝胶珠红外光谱的测定

Alg/TFC凝胶珠、Alg及TFC的红外光谱如图3所示，比较3者的红外光谱，Alg/TFC凝胶珠红外光谱中波数1609 cm-1处Alg羧基的不对称震动吸收峰明显减弱且向高波数移动(蓝移)，另外波数1569 cm-1处CS氨基的特征性剪切震动吸收峰明显减弱。

图3 Alg/TFC(7∶3)凝胶珠(a)、Alg(b) 和TFC(c)的红外光谱

3.4 Alg/TFC复合水凝胶珠形态结构特征

不同比例Alg/TFC复合水凝胶珠SEM如图4所示。Alg/TFC=9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5这几种比例样品的表面和剖面结构形态特征明显。

A(A1-A5)组所示的是不同样品的表面结构，发现随着TFC含量的增加，凝胶珠中褶皱增多，这是由于Alg带有负电荷，而TFC带有正电荷，带有两种相反电荷的聚电解质相互混和时就会形成聚电解质复合物，形成了纤维状的网络结构[18]。

B(B1-B5)组所示的是不同样品的剖面结构，发现随着TFC含量的增加，凝胶珠中褶皱增多，其微小细孔增多，Alg与TFC之间相反电荷的相互使得内部的网状结构更加致密，微小细孔更多。

A组—凝胶珠的表面；B组—凝胶珠的剖面；1～5—Alg/TFC=9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5的不同比例。

3.5 Alg/TFC水凝胶珠的溶胀特性

Alg/TFC水凝胶珠的溶胀率如图5所示。pH值1.2的溶胀特性如图5-A所示，是体外模拟胃环境(SGF)。溶胀率随着TFC在复合水凝胶珠中比例的增加而增加，但溶胀率都比较低，这是因为Alg在酸性较强时，分子之间能够形成氢键，使分子间的作用力增强，故溶胀率较低。

图5 Alg/TFC在SGF(A)、SIF(B)和SCF(C)中的溶胀率

pH值6.8和pH值7.4的溶胀特性分别如图5-B、5-C所示，是分别体外模拟小肠环境(SIF)和结肠环境(SCF)。溶胀率是随着TFC在复合水凝胶中比例的增加而降低。其中Alg/TFC=9∶1的凝胶珠在溶胀60 min后即崩解，是因为Alg含量多，在小肠和结肠环境中，分子间不能形成氢键，且相互排斥，故易于崩解。但Alg/TFC其它比例的凝胶珠溶胀缓慢，这是因为在小肠和结肠环境中，随着TFC在Alg/TFC中比例的增加，Alg带有的负电荷和TFC带有的正电荷相互作用力增加，使得形成的结构致密。其次从SEM图中可知，随着TFC含量的增加，水凝胶珠中的褶皱增多，因此不会迅速崩解。结果表明：Alg/TFC复合水凝胶珠样品在pH值6.8和pH值7.4时的溶胀率分别是pH值1.2时的7倍和10倍左右。

3.6 BSA包载率测定

BSA的包载率如图6所示，假定在24 h内，凝胶珠中包载的BSA完全释放。当BSA的重量占到凝胶珠的20%时，包载率可达到94%以上，同时随着TFC在凝胶珠中总量比例的增加，BSA的包载率也有所上升。这是因为BSA与凝胶载体间特殊的离子环境促成的，凝胶珠包载BSA时的弱酸性条件(pH值5.0)很特别，它高于BSA的等电点(4.7)[19]，却低于壳聚糖链上氨基的pKa值(6.3)[20]。在这种情况下，带负电荷的BSA就会和壳聚糖链上带正电荷的氨基通过静电吸引完成包载。

图6 Alg/TFC复合凝胶珠中BSA的包载率

3.7 BSA的体外释放

不同环境体外模拟测定BSA的释放率如图7所示。pH值1.2 BSA控制释放如图7-A所示，是体外模拟胃环境(SGF)。不同比例样品的释放率均相对较低，2 h内只有6%～10%的BSA从凝胶珠中释放出来，之后其累积释放量的增加量基本保持不变。这与pH值1.2的溶胀率有关，溶胀低，BSA的释放率也低。pH值6.8 BSA控制释放如图7-B所示，是体外模拟小肠环境(SIF)。Alg/TFC=9∶1的释放率在45 min内就达到了70%，而Alg/TFC=5∶5的释放率在2 h后才达到70%。由不同比例样品的SEM图可知，随着TFC的增加，水凝胶珠的褶皱增多，其网状结构增加，使微孔更加细小；又由同pH值下不同样品溶胀率可知，随着样品的溶胀，药物就会溶于水，从载体中释放出来，同时随着TFC的增加，BSA的溶胀率降低；另外，TFC与BSA之间的疏水作用可形成网状结构，随着TFC的增加，凝胶珠与BSA的结合更加紧密。因此，不同比例的样品中，随着TFC含量的增加，药物释放均相对缓慢。其中Alg/TFC=5∶5的释放率最缓慢，达到药物控制释放的要求。不同样品的释放率达到75%左右，并没有达到90%以上，这与pH值6.8环境下的溶胀率有关。pH值7.4 BSA的控制释放如图7-C所示，是体外模拟结肠环境(SCF)。在不同的时间内，BSA的释放率曲线基本与pH值6.8的释放率曲线一致。区别是此pH值下，3 h后BSA的释放率达到了90%以上。这是因为不同比例样品pH值7.4的溶胀率比pH值6.8的溶胀率高。

为了更好地体外模拟胃肠道，我们把Alg/TFC复合水凝胶珠先放入SGF中，然后再放入SCF中，测量BSA的累积释放率。如图7-D所示，发现BSA在SCF中的累积释放率明显高于在SGF中的释放率。这是因为BSA的释放与凝胶珠的溶胀率及其结构有关。

图7 复合凝胶珠中BSA在不同环境中的累积释放率

4 结果

壳聚糖与天然多糖Alg都具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且价格低廉，易于生产，近年来常被广泛用于药物剂型中。本研究采用果糖修饰壳聚糖，极大地改善了壳聚糖的水溶性，再用半胱氨酸修饰果糖-壳聚糖，使其巯基化，以增加肠道的粘附性，从而增加肠道对蛋白类药物的吸收；最后用Alg和TFC的混合溶液在CaCl2和Na2SO4溶液中复合交联制备凝胶珠，通过对其溶胀率和载BSA的包载率及释放率的研究表明：在酸性条件下基本不溶胀崩解，而在近中性pH下可以缓慢溶胀，从而可以达到药物控释的作用。因此这种复合交联的凝胶珠可作为一种潜在的口服蛋白类药物载体。

5 展望

本实验采用果糖修饰壳聚糖，使其溶解性得到很大改善，但是还不能做到使壳聚糖完全溶于水，今后可以用其他的方法改性壳聚糖，使其水溶性进一步提高甚至能够完全水溶。用半胱氨酸修饰果糖-壳聚糖使其巯基化，以增加肠道的粘附性，从而增加肠道对蛋白类药物的吸收，对于本实验是否能更好地增加对蛋白类药物的吸收，并没有用肠粘膜细胞来进一步验证，后续工作可以将此口服蛋白类药物载体用于活体实验。

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