人转铁蛋白偶联交联聚乙烯亚胺体外靶向转染肿瘤细胞

朱雄伟， 苏腾甲， 张佑红， 徐智鹏， 张 凯， 刘玉兰

(1.武汉工程大学化工与制药学院 绿色化工过程省部共建教育部重点实验室, 武汉 430074；2.中船重工第七一二研究所， 武汉 430074； 3.武汉工程大学材料科学与工程学院, 武汉 430074)

随着分子生物学和免疫学的快速发展，与肿瘤基因治疗相关的研究工作正在不断深入。近年来，非病毒基因传递体系成为了国内外研究的热点和重点[1]。与病毒载体相比，非病毒载体具有低免疫反应，无基因片段大小限制，使用简单，制备方便，便于保存等优点[2]。自Boussif等[3]报道了聚乙烯亚胺(PEI)可作为非病毒载体之后，PEI成为了非病毒基因载体中研究最多的效果最好的经典载体材料。然而目前PEI在肿瘤基因治疗上的效果并不令人满意，其中很重要的原因在于高分子量的PEI毒性大且缺乏肿瘤靶向性。为了解决这个问题，各种可降解的键被用来合成交联低分子量PEI，如酯键和二硫键等，以此得到可降解的交联PEI载体，使它具有高效低毒性的特性[4]。此外，给PEI偶联上配体，通过受体介导的内吞途径进入靶细胞，可以显著增加载体的转染效率和靶向性。偶联的配体有很多种，如半乳糖、甘露糖、内皮细胞生长因子、转铁蛋白、RGD肽、叶酸以及各种单抗等[5]。近年来，国内外研究人员报道了许多与转铁蛋白介导基因肿瘤靶向传递相关的研究工作，结果均表明转铁蛋白具有很强的肿瘤特异性，能显著提高载体在肿瘤细胞中的转染效率。

由于恶性肿瘤细胞表面过度表达转铁蛋白受体，所以本研究将交联低分子量PEI与人转铁蛋白偶联，制备了一种新型肿瘤靶向人转铁蛋白偶联交联聚乙烯亚胺基因载体。通过载体上的转铁蛋白配体与肿瘤细胞表面表达的转铁蛋白受体结合，可特异性将外源基因导入靶细胞，从而增强该载体对恶性肿瘤细胞的转染效率和靶向性，增强恶性肿瘤基因治疗的疗效。对该载体的各项性能、细胞毒性和体外转染效率都进行了全面、细致地研究和评估。

1 材料与方法

1.1 实验材料

聚乙烯亚胺(分子量18kDa)购自美国Alfa Aesar公司。聚乙烯亚胺(分子量25kDa)购自美国Sigma公司。人转铁蛋白和环硫乙烷购于美国Sigma公司。甲醇和二甲亚砜购于上海国药集团化学试剂有限公司。DMEM培养基、胎牛牛血清、胰蛋白酶、双抗(青霉素-链霉素)、PBS缓冲液、噻唑兰均为Invitrogen公司产品。还原型谷胱甘肽购于上海三杰生物技术有限公司。荧光素酶检测试剂盒购于美国Promega公司。所有试剂均为分析级，购回后直接使用。

1.2 实验方法

1.2.1 质粒DNA的提取和纯化

本实验使用了萤光素酶(pGL-3)和增强型荧光蛋白(pEGFP)两种报告基因质粒。pGL-3在JM109大肠杆菌中转化，pEGFP在DH5α大肠杆菌中转化。两种菌均用LB培养基培养，在37℃下，250r/min的摇床中扩增12 h。采用Omega公司的无内毒素质粒大提试剂盒，从菌液中提取和纯化质粒DNA，用超纯水洗脱，无菌过滤，所得质粒DNA的水溶液冻存于-80℃。

1.2.2 交联PEI的合成

在25 mL圆底烧瓶中，将500 mg 1800 Da PEI溶于3 mL去离子水中，用0.1 M HCl溶液将溶液pH值调至7。减压旋干，得到黄色固体。将该固体溶于3 mL CH3OH中，并转移至聚合管中，通入氩气，加入一定量的环硫乙烷后封管，磁力搅拌，在50℃油浴下反应24 h。反应完毕后，产物减压旋干，得到巯基化的PEI。将1 g 巯基化的PEI溶于2 mL CH3OH中，然后加入1 mL DMSO，50℃油浴反应48 h。反应完毕后所得的溶液在乙醚中沉淀3次，真空干燥后得到交联PEI。

1.2.3 TCP的合成

取100 mg饱和Tf溶解在1 mL pH值5.5的NaAc缓冲液中，加入0.5 mL 50 mmol/L 高碘酸钠，反应0.5 h。粗产物用葡聚糖G 25柱层析脱盐。以0.1 mol/L NaAc缓冲液(pH值5.5)为洗脱剂。在270 nm处监测馏分，收集氧化后的Tf，用超速离心管浓缩，稀释至0.1 mmol/L，然后取一定量加到交联PEI的NaCl溶液中(300 mg/5 mL)，室温搅拌30 min后，分少量多次加入2 mg 氰基硼氢化钠，继续搅拌24 h，用3 M NaCl溶液将混合液的盐浓度调节至0.5 M。反应物过阳离子交换柱，在20 mM HEPES(pH值7.3)的条件下，以0.5～3M 的NaCl溶液进行梯度洗脱，合并在1.7～3M盐浓度下收集的洗脱液，透析冻干，得到最终产物TCP，冻存于-80℃ 。

1.2.4 复合物粒径和电位测定

TCP/DNA复合物的粒径和电位使用粒度及zeta电位分析仪( zetasizer Nano ZS90，Malvern，英国)测定。将TCP 和质粒DNA(pGL-3)分别溶于去离子水中，配成浓度分别为1 mg/mL和200 ng/μL的水溶液，不同(质量比)w/w比的TCP/DNA复合物。 混匀后，在室温放置30 min，然后将复合物溶液用150 mM NaCl溶液稀释到1 mL来测定复合物的粒径。用超纯水稀释到1 mL来测定复合物的zeta电势。

1.2.5 琼脂糖凝胶电泳

将W/W比为5、10、15、20、25 和30 的TCP/DNA复合物样品和其对应的与60 mM还原型谷胱甘肽混合后的样品，分别加入含有GelRed染料的0.7%琼脂糖凝胶中进行电泳实验(80 V，80 min)，然后在凝胶成像仪下经紫外照射成像。

1.2.6 细胞培养

人肝癌细胞株(HepG2)、人子宫颈癌细胞株(Hela)和人胚胎肾细胞株(293T)用含10%胎牛血清 (FBS)、2 mg/mL NaHCO3和100 U/mL双抗 (1%的青霉素-链霉素10000 U/mL) 的DMEM (Gibco) 培养基在37℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2.7 体外细胞毒性

用MTT法测定聚合物的细胞毒性。将Hela细胞以5000个/孔的密度接种于96孔板，培养24 h后将TCP水溶液按浓度梯度加至孔中。37 ℃培养24 h，吸弃旧液，用新鲜DMEM培养基继续培养24 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，37 ℃培养4 h，吸弃旧液，加入DMSO 150 μL。以正常培养的细胞作为阴性对照，用Bio-Rad酶标仪测定570 nm处吸收度值，计算细胞生存率。

1.2.8 体外细胞转染实验

将HeLa细胞或A549细胞以细胞数为6×105/孔接种于24孔板，培养24 h后分别加入w/w为5、10、15和20的TCP/DNA复合物，每孔加入含1 μg质粒的复合物，孵育一定时间后，吸弃旧液，加入新鲜培养液继续培养48 h保证蛋白质的充分表达。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。在相同的实验条件下，同时进行了25 kDa PEI与DNA复合物的转染实验，作为阳性对照。

2 结果与讨论

2.1 复合物的粒径和电位

按照1.2.4粒径和电位测试方法结果如图1。

图1 TCP/DNA复合物在w/w为5～30范围内的粒径和zeta电位

当W/W比在5～30之间时，TCP/DNA复合物的平均粒径约为155 nm。粒径随着w/w比的增大而缓慢增加，这可能是由于材料浓度的增大而导致复合物颗粒之间发生了聚集。TCP/DNA复合物的平均表面电位约为+21.6 mV，因此它能将带负电的DNA紧密包裹，阻止核酸酶对DNA的降解，它也能很好的与带负电的细胞膜结合，促进细胞对复合物的内吞。

图2 TCP/DNA复合物(w/w= 0～7)的凝胶电泳

A—无谷胱甘肽；B—有谷胱甘肽。

2.2 凝胶电泳实验

按照1.2.5实验方法得到在TCP/DNA复合物在0～7的范围内有无谷胱甘肽实验结果如图2。

聚阳离子与DNA的结合能力是基因能够成功传递至细胞内部的重要因素之一，当TCP在W/W大于2时，各孔中的DNA条带清晰明亮，说明TCP能与质粒DNA完全复合，且这些w/w可被用在之后的转染实验中(见图2A)。用还原型谷胱甘肽模拟细胞中谷胱甘肽对二硫键的降解，结果表明各孔DNA都有明显出孔或拖尾现象(见图2B)。原因可解释为：二硫键能够在谷胱甘肽存在下断裂，而细胞内的谷胱甘肽浓度是细胞外的50倍以上，因此在细胞外TCP能与DNA形成稳定的复合物，而进入细胞后，二硫键被氧化断裂，释放出DNA。

2.3 体外细胞毒性

基因载体的细胞毒性对于该载体以后的临床应用来说非常关键，毒性大必然限制了其进一步的应用，所以按照1.2.7体外细胞毒性实验方法得到结果如图3。

图3 TCP的细胞毒性

TCP在Hela细胞中的MTT毒性实验结果表明，与25 Kda PEI相比，TCP的毒性很低，各个浓度对应的细胞存活率均超过75%，这是因为TCP的主要组成部分是可降解的、生物相容性好的低分子量PEI，从而使材料的毒性大幅降低。此外，随着TCP浓度的增大，细胞毒性略有增加。

图4 TCP/pGL-3复合物在Hela、HepG2和293T细胞中的体外转染效率

2.4 细胞转染效率

按照1.2.8中的体外细胞转染实验方法，不同的TCP/DNA复合物W/W对3种细胞系的影响，及PEI阳性对照试验结果如图4。

对3种细胞系的体外转染结果表明，TCP/DNA复合物在Hela细胞和HepG2细胞中的转染效率明显高于PEI(25 kDa)/DNA复合物的转染效率。但是，在293T细胞中转染效率的变化没有其他两个细胞系显著。比如，荧光素酶转染数据显示，当W/W为15时，TCP/pGL-3复合物在Hela细胞中的转染效率与25 kDa PEI对应的转染效率相比，前者比后者提高了3个数量级。根据报告基因的转染结果可以证实，TCP载体能大幅增强外源基因在肿瘤细胞中的转染效率，且转染具有显著的肿瘤靶向性。

3 结论

本研究中合成的人转铁蛋白偶联交联聚乙烯亚胺基因载体(TCP)是一种具有肿瘤靶向能力的、低毒高效的非病毒聚阳离子载体。其二硫键能在细胞质中降解因而能够大幅降低材料的毒性。通过偶联的转铁蛋白配体与肿瘤细胞表达的转铁蛋白受体间的相互作用，可增强该载体对肿瘤细胞的转染效率和靶向能力。

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