黑曲霉WZW001液态发酵产果胶酶的工艺条件优化

吴鹏飞，魏 春，沈江伟，徐 力，汪 钊

（浙江工业大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310014）

果胶酶（Pectinase）是一种复合酶，主要由植物和微生物合成。果胶酶的应用范围很广，主要包括食品、环保、医药和纺织等领域[1-3]，特别是应用于水果与农副产品加工中，对于提高果汁的出汁率，改善过滤效果及澄清作用效果显著[4]。果胶酶的生产有40多年的历史，传统的生产方法采用固态发酵法，但固态发酵法存在设备放大困难，自动化程度偏低，工艺参数不易控制等缺陷。且随着国内对果胶酶需求的增加及对外贸易的发展，果胶酶的需求日益迫切，固态发酵法在品质及产量上难以满足市场的需求。而液态发酵工艺与固态发酵法相比具有易实现连续自动化生产，生产规模大，易控制等优点[5-7]，为此进行了黑曲霉WZW001的产果胶酶的液态发酵工艺研究。

1 材料与方法

1.1 菌种

黑曲霉（Aspergillus niger）WZW001，由浙江工业大学发酵工程研究所提供。

1.2 培养基及培养条件

培养方法：接种一环PDA斜面孢子至种子培养基，温度30℃，摇床转速200 r/min培养1天。接种3 mL种子液至发酵培养基，培养温度30℃，摇床转速200 r/min，培养3天。无特别说明，装液量均为250 mL三角瓶装30 mL。

葡萄糖土豆浸出汁培养基（PDA培养基）：马铃薯洗净去皮，称取200 g马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20～30 min）。四层纱布过滤取滤液，加入200 g琼脂及200 g葡萄糖，搅拌均匀，冷却后补足水分至1 000 mL，121℃灭菌20 min。

种子培养基(g/100 mL)：橘皮粉 1 g，麸皮 3 g，硫酸铵 1 g，KH2PO40.3 g，MgSO40.05 g，初始 pH 5.0。

发酵培养基(g/100 mL)：橘皮粉 1.5 g，麸皮 2 g，硫酸铵 1.5 g，KH2PO40.3 g，MgSO40.05 g，初始 pH 5.0。

1.3 果胶酶活力的测定方法及定义[8]

粗酶液的制备：发酵液在4℃，10 000 r/min离心7 min后取上清液作为粗酶液，用于酶活力测定。

测定方法及定义：吸取0.2 mL适当稀释的粗酶液于试管中，加入1.8 mL pH 3.5缓冲液配制的1%果胶底物溶液，50℃水浴反应30 min后加2 mL DNS终止反应，沸水浴10 min。冷却后吸取0.5 mL定容至10 mL，摇匀，在550 nm下测定其吸光值。酶活力定义：果胶酶降解果胶每分钟产生1 μmol还原糖定义为一个酶活力单位。

2 结果与分析

2.1 产酶培养基的优化

2.1.1 麸皮添加量对产酶的影响

碳源是重要的功能物质，通过查阅相关文献并考虑到经济性，选择麸皮作为最佳碳源[9,10]。研究了不同麸皮添加量对产酶的影响，结果表明果胶酶活力随着麸皮添加量的增加呈先上升后下降的趋势，麸皮的最适添加量为4 g。

2.1.2 不同氮源和添加量对产酶的影响

氮源对于微生物生长及产酶影响很大，因此研究了不同氮源对黑曲霉WZW001产果胶酶的影响。研究结果由图2可知：有机氮源较无机氮源更有利于菌株产酶，原因可能是有机氮源（如蛋白胨和酵母膏）成分比较复杂，富含大量微生物生长代谢必需的微量元素。

其中有机氮源蛋白胨为产酶最高的氮源，无机氮源磷酸氢二铵、硫酸铵其次，考虑到蛋白胨价格昂贵，不利于降低培养基的成本；此外硫酸铵易溶水，对发酵液粘度影响小，有利于发酵传质增加发酵液的含氧量，因此选择 (NH4)2SO4为黑曲霉WZW001发酵产果胶的最适氮源。

图1 麸皮添加量对产酶的影响

图2 不同氮源对产酶的影响

图3 硫酸铵添加量对产酶的影响

研究了不同硫酸铵添加量对产酶的影响，图3可知果胶酶酶活力随硫酸铵呈先上升后下降的趋势，添加量1.0 g时，果胶酶活力最高，为最适添加量。根据相关文献报道，合适浓度的无机氮源（以硫酸铵效果更好）能显著提高产酶。

图4 橘皮粉添加量对产酶的影响

图5 不同金属离子对产酶的影响

2.1.3 诱导物添加量对产酶的影响

果胶是黑曲霉产果胶酶的诱导物，对产酶有很大的影响，考虑到纯果胶价格昂贵，用富含果胶的橘皮粉替代果胶有利于降低发酵的成本，而且橘皮粉还可以提供其他营养成分，进一步提高菌株产酶能力。通过实验发现加入0.5%橘皮粉时对酶活力的提高就有作用。研究结果表明当橘皮粉添加量从0.5 g增加至2.0 g时，产酶逐渐增加。但是添加更多的橘皮粉将导致酶活力下降，橘皮粉最适添加量为2.0 g。

2.1.4 不同金属离子及添加量对产酶的影响

不同金属离子能促进或者抑制微生物产酶，因此研究了不同金属离子对黑曲霉WZW001发酵产果胶酶的影响。研究结果如图5可知：在金属元素中CaCl2,CuSO4,KCl对产酶有较大的促进作用，而钼酸钠则对菌株产酶有较强的抑制作用。

选择CaCl2,CuSO4,KCl三个因素作为影响产酶的主要因子，在单因子试验的基础上选用L9(34)正交表进行三因素三水平正交试验，研究不同水平添加量对产酶的影响。试验因素和水平如表1，结果和极差分析如表2。

表1 产果胶酶正交设计的试验因素和水平

表2 正交试验结果

由表2的正交实验结果可知，A,B,C三因素中对菌株产果胶酶影响最大的因素为B（CuSO4），其次为 C（KCl），A（CaCl2）的影响最小。 分析结果表明A1B1C1为最佳组合，即黑曲霉WZW001发酵产果胶酶的最佳金属元素组合为CaCl20.02 g，CuS040.02 g，KCl 0.02 g。

2.2 产酶发酵条件优化

2.2.1 培养温度对产酶的影响

图6 不同温度对产酶的影响

采用最适合培养基，研究了20℃，25℃，27℃，30℃，33℃，35℃，40℃温度条件下对菌株产酶的影响。结果如图6可知，随着温度的上升酶活也在提高，在30℃时酶活达到最大，之后温度继续上升酶活下降。原因可能是在30℃之前，温度升高菌体生长和代谢能力加强，产酶能力上升；温度继续增加，导致菌体提前衰亡，菌体代谢受到影响，该菌株发酵产果胶酶的最适温度是30℃。

图7 初始pH值至对产酶的影响

图8 不同接种量至对产酶的影响

2.2.2 培养基初始pH对产酶的影响

研究了初始pH值对菌株发酵产果胶酶的影响。研究结果如图7所示：发酵培养基产酶的最适pH 4～6，当pH值为6.0时，产果胶酶活力最高，为最适pH。

2.2.3 接种量对产酶的影响

在250 mL三角瓶中装入30 mL培养基，研究了不同接种量对菌株发酵产果胶酶的影响。研究结果如图8所示：随着接种量的增大酶活反而降低，接种量为2 mL时产酶活力最高，果胶酶酶活力为54.65 u.mL-1。这可能是因为在有限的营养成分中过高的接种量使得营养消耗过快，菌体的生长受到抑制。

3 结 论

黑曲霉WZW001的液态发酵培养基简单，以低成本的麸皮、橘皮粉农副产品为主要原料，不仅产酶活力较高，而且成本低廉。通过对培养基和发酵条件的优化可知，黑曲霉WZW001发酵产果胶酶的最适培养基的组成为（g/100 mL）：麸皮4 g，硫酸铵 1 g，橘皮粉 2 g，K2HPO40.3 g，MgSO40.05 g,CaCl20.02 g，CuSO40.02 g，KCl 0.02 g； 最适发酵条件为：初始pH 6.0，发酵温度30℃，接种量2 mL/100 mL。最终果胶酶活力可达54.65 u.mL-1，比优化前提高了45.2%。

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