阳明腑实证大鼠小肠神经-ICC网络形态学损伤和下法施治研究

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(大连医科大学 附属第一医院 中西医结合外科，辽宁 大连 116011)

基础医学

阳明腑实证大鼠小肠神经-ICC网络形态学损伤和下法施治研究

梁国刚，谢明征，曹万龙，严露，齐清会

(大连医科大学 附属第一医院 中西医结合外科，辽宁 大连 116011)

目的观察阳明腑实证大鼠小肠神经-Cajal 间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)—平滑肌细胞网络的形态学变化，探讨阳明腑实证胃肠运动障碍的产生机制及下法的作用机制。方法成年Wistar大鼠100只，雌雄不限，随机分成3组，对照组20只；阳明腑实证模型组40只；大承气汤治疗组40只。存活大鼠取上段小肠10.0 cm组织制作肠肌层全厚组织标本，进行c-Kit和乙酰胆碱转运体(VAChT)/一氧化氮合酶(nNOS)免疫荧光双标记染色后用于激光扫描共聚焦显微镜检测、分析。结果(1)共聚焦显微镜检测ICC网络：与对照组相比，模型组大鼠小肠ICC数量明显减少(P<0.01)，ICC突触的数量减少，相互间的连接不连续，完整的网络样结构消失，细胞荧光强度减弱(P<0.01)。(2)共聚焦显微镜检测肠神经-ICC网络：与对照组相比，模型组胆碱能/氮能神经数目明显减少(P<0.01/P<0.01)，神经网结构紊乱，彼此间的连接减少，神经网络的荧光强度减弱(P<0.01/P<0.01)；ICC与肠神经纤维两者间失去紧密连接，肠神经-ICC网络的完整结构受到破坏。 (3)治疗组较模型组ICC数量明显恢复(P<0.01)，网络样结构的完整性有所恢复，与模型组比较细胞荧光强度明显增强(P<0.01)。胆碱能神经/氮能神经纤维数目明显增加(P<0.01)，神经网络结构再次好转，彼此间的网络连接的完整性恢复明显，神经网络的荧光强度增加(P<0.01)，ICC与肠神经纤维间的连接接近正常，ICC-肠神经网络结构恢复明显。结论阳明腑实证大鼠小肠ICC和神经网络受到破坏。大承气汤治疗后小肠胆碱能/氮能神经和ICC数量恢复，肠神经-ICC网络结构得到改善。

阳明腑实证；Cajal间质细胞；肠神经

阳明腑实证是指在外感热病病程中所出现的邪热内炽，又伴有腹部实证症状的一组临床常见全身性综合证候。如不能得到及时诊治，常可导致多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),最终危及生命[1]。肠神经-ICC-平滑肌细胞网络是胃肠道动力功能基本单位，胃肠道兴奋性神经递质乙酰胆碱(acetylcholine,ACH)引起平滑肌的收缩，增加基础张力或节律性收缩的幅度。肠道抑制性神经递质一氧化氮(nitric oxide,NO)引起平滑肌松弛，抑制基础张力或节律性收缩活动。多种胃肠道运动功能障碍疾病与肠神经-ICC-平滑肌细胞网络形态结构损伤密切相关。本实验以阳明腑实证大鼠模型为研究对象，观察小肠神经-ICC网络的形态学变化，探讨阳明腑实证胃肠运动障碍的产生机制，为临床治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

实验动物由大连医科大学实验动物中心提供。大肠杆菌(E.coli.)菌株由大连医科大学附属第一医院细菌室所提供，血清型O127：H6，用无菌蒸馏水制成8×108个/mL混悬液。兔抗大鼠c-kit多克隆抗体(c-19，Santa cruz,Biotech,USA)；山羊抗大鼠VAChT(vesicular acetylcholine transporter)多克隆抗体；山羊抗大鼠nNOS(neuronal nitric oxide synthase)多克隆抗体；FITC-小鼠抗兔IgG抗体；Texas Rad-驴抗山羊IgG抗体(均为Santa cruz,Biotech,USA)。

中药“大承气颗粒冲剂”由天津南开医院药厂提供，成分为：大黄12 g，芒硝6 g，厚朴9 g，枳实9 g。每剂药物加入无菌蒸馏水36 mL，溶解制成含生药100%的药液(1 g/mL)。药物灌胃前加温至37 ℃。阳明腑实证造模应用中药：附子、肉桂、干姜由大连医科大学附属第一医院中药房提供，附子∶肉桂∶干姜以1∶1∶1比例制成水煎剂4 ℃保存。

1.2 动物分组

健康成年Wistar大鼠100只(大连医科大学动物实验中心提供)，雌雄各半，体重200～250 g，随机分为3组：对照组20只；阳明腑实证模型组(模型组)40只；大承气汤治疗组(治疗组)40只。造模48 h后，以上每组存活动物标本用于激光扫描共聚焦显微镜检测。

1.3 阳明腑实证模型制作和大承气汤药物治疗方法

动物模型制作：参照樊新荣等[2]阳明病肠热腑实证造模方法。每天用附子、肉桂、干姜水煎剂灌胃,公斤体重计算其给药量按(20 g/kg)。用药12 d后，禁食(不禁水)12 h，给100 g/L大鼠自身粪便混悬液2 mL灌胃，2次/d，连续2 d；第3天用8×108个/mL大肠杆菌灭活菌液，0.1 mL腹腔内注射，15 d后造模成功。对照组用等剂量的生理盐水。治疗组，造模成功当日开始每天中药大承气汤灌胃，2次/d，每次1 mL/100g。中药治疗5 d后取小肠组织用于实验。记录各组大鼠的死亡率，同时观察并记录造模中大鼠的毛发色泽、行为状态、饮食、大便等外观方面的变化。

1.4 激光扫描共聚焦显微镜观测

1.4.1 小肠肌层全厚标本制备

取对照组、模型组、治疗组存活大鼠予脱颈处死，迅速取出距幽门2 cm的上段小肠。沿系膜缘剖开去除内容物，在解剖显微镜下，用显微解剖镊将黏膜和黏膜下层作为一层剥除，制作小肠肌层全厚标本。将标本切成1 cm2大小片段放于4 ℃丙酮中固定10 min。1%BSA孵育 1 h，分别加入乙酰胆碱转运体(VAChT)和一氧化氮合酶(nNOS)抗体，4 ℃孵育48 h，PBS充分漂洗后加入Texas Red标记的二抗室温下孵育1 h。

1.4.2 共聚焦显微镜检测: 以适于FITC(484 nm)和Texas Red(595 nm)的激发波长观测标本。用于图像采集的显微镜物镜为40×油镜，数值孔径为1.3,c-Kit阳性荧光为绿色，VAChT/nNOS阳性荧光为红色。采用双通道同步扫描，测量每一视野免疫阳性组织的面积。根据每一标本的扫描厚度分别计算标本VAChT及nNOS免疫阳性组织的体积。得到每个视野各种免疫阳性组织占总体积的百分比,每组取3个标本检测，每一标本随机选取3个高倍视野，用Leica图像分析软件进行图像的三维重建和荧光半定量分析。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 动物的一般表现

模型组动物精神萎靡不振，行动迟慢，但触之易激惹，挣扎无力，进食量较少，体重略有下降，排便次数少且大便干结，偶有成硬球，模型组动物5天后的死亡率32.5%。治疗组动物精神稍欠佳，第2 d精神好转，行动活泼，挣扎有力，进食量逐日增加，大便稀软，偶有成型，呈棕褐色，死亡率12.5% (P>0.05)。

2.2 胃肠大体标本肉眼观察

对照组大鼠：胃肠形态正常，所有肠管呈粉红色，无粘连，胃肠蠕动正常。阳明腑实证模型组：胃肠极度扩张，内容物和大量气体滞留于胃肠内，浆膜充血肿胀，网膜可见有出血斑点，腹腔内少量渗出液，部分出现血性腹水，均呈略混浊，腹腔内存在感染现象。大部分肠管呈灰色，系膜肥厚，肠腔内大量液体潴留，潴留液为粪水样液体，明显存在慢性肠道动力功能减弱征象。治疗组：胃肠道内潴留物较少或胃内无物滞留。肠壁红润，肠壁和系膜无水肿，肠道蠕动功能良好。

2.3 激光扫描共聚焦显微镜检测

对照组：ICC在环纵行肌间神经丛自身形成网络样结构。胆碱能神经和氮能神经彼此相接形成网状结构，神经网络含有成串的神经节。ICC网络围绕着胆碱能神经和氮能神经并与之形成网络。ICC长的突触与肌纤维平行走行，短的突触彼此相连并与神经纤维和平滑肌纤维紧密连接；ICC、胆碱能神经,氮能神经荧光强度均匀，肠神经-ICC网络结构完整。

模型组：ICC数量明显减少(表1)，完整的网络样结构消失，细胞荧光强度减弱(表2、图1)。胆碱能神经(图2)和氮能神经(图3)纤维数目明显减少(表1)，神经网络结构紊乱，彼此间的连接减少，神经网络的荧光强度减弱(表2)；ICC与胆碱能神经(图4)和氮能神经(图5)间的连接松散或消失，ICC-肠神经网络结构遭受明显破坏。

治疗组： ICC数量较模型组明显恢复(表1)，网络样结构已恢复，细胞荧光强度增强(表2，图1)。胆碱能神经(图2)和氮能神经(图3)纤维数目明显增加(表1)。神经网络结构再次好转，彼此间的连接增加，神经网络的荧光强度增加(表2)，ICC与胆碱能神经(图4)和氮能神经(图5)间的连接接近正常，ICC-肠神经网络结构恢复明显。

表1 ICC-神经网络计数分析

c-Kit免疫阳性细胞VAChT阳性神经纤维nNOS阳性神经纤维对照组(n=20)24±2．519±1．928±0．5模型组(n=27)6±0．81)9±0．91)5±0．31)治疗组(n=35)8±0．52)13±1．12)7±0．52)

1)与对照组比较，P<0.01；2) 与模型组比较，P<0.01

表2神经-ICC网络荧光半定量分析

c-Kit免疫阳性VAChT阳性神经nNOS阳性神经对照组(n=20)33±2．4233±9．4253±3．4模型组(n=27)9±2．71)56±4．11)82±3．01)治疗组(n=35)25±1．22)104±8．22)111±9．72)

1)与对照组比较，P<0.01；2)与模型组比较，P<0.01

图1 对照组、模型组和治疗组ICC荧光表达的比较

a: 对照组， b:模型组，c:治疗组。模型组与对照组比较，ICC数目减少，细胞荧光减弱，ICC网络结构模糊不清，结构紊乱。治疗组ICC数目，ICC荧光度增强。ICC网络结构清晰，结构完整。(蓝色箭头：ICC)

图2 对照组、模型组和治疗组VAChT阳性神经荧光表达的比较

a: 对照组， b:模型组，c:治疗组。模型组与对照组比较，胆碱能神经纤维数目减少，荧光减弱，神经网络结构紊乱，神经纤维间模糊不清。治疗组胆碱能神经纤维数目增加，荧光度增强，神经纤维清晰可见，神经网络结构完整。(灰色箭头：胆碱能神经)

图3 对照组、模型组和治疗组nNOS阳性神经荧光表达的比较

a: 对照组， b:模型组，c:治疗组。模型组与对照组比较，氮能神经纤维数目减少，荧光减弱，神经纤维间结构模糊不清，神经网络结构破坏。治疗组氮能神经纤维数目增加，荧光度增强，神经纤维间结构清晰，神经网络结构恢复。(灰色箭头：氮能神经)

图4 对照组、模型组和治疗组c-kit荧光和VAChT阳性神经荧光双标记表达的比较

a: 对照组， b:模型组，c:治疗组。模型组与对照组比较，胆碱能神经-ICC网络结构紊乱，彼此间的连接结构模糊不清，减少，胆碱能神经-ICC网络的荧光强度减弱。治疗组胆碱能神经-ICC网络结构恢复，彼此间的连接结构清晰，数目增加，胆碱能神经-ICC网络的荧光强度增强。(灰色箭头：胆碱能神经；蓝色箭头：ICC)

图5 对照组、模型组和治疗组c-kit荧光和nNOS阳性神经荧光双标记表达的比较 Fig 5 Compare of doublelabelling fluorescent c-kit and nNOS nerves in control group,model group and therap group

a: 对照组， b:模型组，c:治疗组。模型组与对照组比较，氮能神经-ICC网络结构紊乱，彼此间的连接减少，彼此间的连接结构模糊不清，氮能神经-ICC网络的荧光强度减弱。治疗组氮能神经-ICC网络结构恢复，彼此间的连接结构清晰，数目增加，氮能神经-ICC网络的荧光强度增强。(灰色箭头：氮能神经；蓝色箭头：ICC)

3 讨 论

阳明腑实证是诸多急腹症发病过程中共同出现的一个证候，可以概括为两大类型的实证：一为燥热亢盛，肠胃无燥屎阻结的热证；二为燥热之邪与肠中糟粕相搏结而成燥屎的实证。若邪热炽盛,津伤热结,阳明气机通降则受障碍,从而产生阳明腑实之证[3]。参考樊新荣等方法，以中医理论为指导，建立阳明腑实证模型。实验观察大鼠外观行为、体温、小肠运动功能等改变证实该方法比较符合阳明腑实证的中医病因病机。实验大鼠出现精神和行为改变，出现纳差，便秘。胃肠功能受损和腹腔感染现象。这可能是模型组动物死亡(32.5%)的原因之一。

胃肠运动的作用细胞是平滑肌细胞。调控平滑肌细胞的内在神经系统以肌间神经丛的肠神经-Cajal-平滑肌细胞网络为调控肠道运动功能的基本单位。ICC与壁内神经及平滑肌间存在密切的三维联系。它们之间形成的特殊结构“肠神经-ICC-平滑肌细胞”是胃肠动力功能的基本结构单位。胃肠道平滑肌都受两种运动神经元支配，即肠道兴奋性神经元及肠道抑制性神经元。肠道兴奋性神经元的主要递质乙酰胆碱(acetylcholine,ACH)引起平滑肌的收缩，增加基础张力或节律性收缩的幅度。肠道抑制性神经元的主要递质一氧化氮(nitric oxide,NO)引起平滑肌松弛，抑制基础张力或节律性收缩活动。本研究发现阳明腑实证组大鼠小肠胆碱能神经纤维数量减少,神经纤维荧光强度减弱，神经网络样结构受到破坏。因此认为阳明腑实证大鼠小肠肌间神经丛胆碱能神经减少和胆碱能神经网结构的破坏可能是胃肠电节律失常的一个重要原因，并由此进一步导致胃肠运动障碍。大承气汤治疗后，乙酰胆碱神经数目增加，荧光强度增加，是因为乙酰胆碱浓度，神经纤维，神经元和受体的恢复，进而影响乙酰胆碱对平滑肌细胞的兴奋性控制恢复，并恢复胃肠道运动功能。研究发现ICC-DMP受胆碱能和氮能神经双重支配，ICC-DMP与肠神经以及邻近的平滑肌细胞间存在特殊的连接[4]。本研究中阳明腑实证动物胃肠功能减弱时，小肠肌间神经丛形态学发生了改变，氮能神经细胞数目明显减少，荧光强度减弱，氮能神经网络出现紊乱，网络结构受到损伤，提示阳明腑实证大鼠小肠肌间神经丛氮能神经数目和网络结构改变抑制平滑肌蠕动是导致胃肠运动障碍的原因之一。实验动物灌服大承气汤后，氮能神经纤维数目增加，荧光强度有所恢复，网络结构恢复，提示氮能神经对平滑肌抑制性蠕动恢复是治疗组胃肠动力功能恢复的原因。

肠神经-Cajal-平滑肌细胞网络中肠神经和Cajal 组成的网络连接的完整性以及细胞数量的多少对小肠运动功能起到决定性的影响[5-8]。ICC位于神经末梢和平滑肌之间，介导神经与平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)之间的信号的传导。通过ICC与平滑肌细胞的缝隙连接产生兴奋性连接电位(excltory 1unction potential，EJP)，使平滑肌细胞产生去极化。本研究发现，当阳明腑实证大鼠小肠的ICC数目减少，ICC相互连接减少，网络状结构损伤时，胃肠道动力功能下降。这一实验结论提示胃肠道内肠神经及ICC的异常改变可能引起ICC节律起搏和传播功能的形态学基础受到破坏，导致胃肠电节律起搏和神经传导功能受到影响；肠运动神经相互间的网络联系遭到破坏，胃肠神经信号无法正常传导。大承气汤治疗后，胃肠动力功能的恢复和神经网络结构恢复有关。总之，当ICC与肠神经纤维间存在的联系结构显著减少，小肠肌层神经-ICC网络结构受到破坏，神经末梢与ICC之间的突触样连接以及ICC之间的缝隙连接损伤或消失时，将引起肠神经信号减弱或向ICC和平滑肌传导的形态学基础受损，其慢波传导和神经肌电活动功能必然受到影响，从而破坏了胃肠运动功能的基本单位：肠神经系统-ICC-平滑肌细胞网络，导致阳明腑实证大鼠胃肠动力功能失调。

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Morphologicalchangesofentericnerve-interstitialcellsofCajal-smoothmusclecellsnetworkinYangMingFuShisyndromeandtherapeuticmechanismofXia-Faintraditionalchinese

LIANGGuo-gang,XIEMing-zheng,CAOWan-long,YANLu,QIQing-hui

(SurgeryofIntegratedTraditionalandWesterMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China)

ObjectiveTo observe the morphological changes of enteric nerve and ICC of enteric nerve-ICC-smooth muscle cells network in rats with Yang Ming Fu Shi Syndrome,and to investigate the function of gastrointestinal motility and the therapeutic Mechanism of Xa-Fa in Traditional Chinese.MethodsOne handred Wistar rats of both sexes were randomly divided into three groups,the contrpl group 20 rats,the model group 40 rats and the therap group 40 rats. The proximal 10.0 cm segment of jejunum beginning 2 cm distal to the pylorus from each group,was studied using c-Kit and vesicular acetylcholine transporter (VAChT)/ neuronal nitric oxide synthase (nNOS) immunohistochemical double-staining with whole-mount preparation technique and confocal laser scanning microscopy.ResultsChange of enteric nerve-ICC net work with confocal laser scanning microscopy:Model group: Compare with control group,the numbers of ICC were significantly decreased (P<0.01),network was disrupted,fluorescence intensity of ICC decreased. Compare with control group,the numbers of vesicular acetylcholine transporter (VAChT) and neuronal nitric oxide synthase (nNOS) were significantly decreased (P<0.01),nerves network disordered,each connection decreased,fluorescence intensity of enteric nerve decreased(P<0.01).The connection of ICCs and enteric nerves were loosen or disappeared.ICC- enteric nerve network was significantly disrupted.Treat group: Compare with control group,the numbers of ICC were significantly increased (P<0.01),network was recovered,fluorescence intensity of ICC increased. the numbers of vesicular acetylcholine transporter (VAChT) and neuronal nitric oxide synthase (nNOS) were significantly increased (P<0.01),network was recovered,fluorescence intensity of nerves increased (P<0.01). The connection of ICCs and enteric nerves were approaching normal,ICC- enteric nerve network was significantly recovered.ConclusionGastrointestinal tract distended in Yang Ming Fu Shi Sydrom rats. Function of gastrointestinal was significantly disordered; and recoveried after Da Cheng Qi decoction treated.In Yang Ming Fu Shi Sydrom rats,numbers of vesicular acetylcholine transporter (VAChT) and neuronal nitric oxide synthase (nNOS) were significantly decreased; and numbers of ICC were decreased too.entric nerve-ICCnetwork was disrupted; after treated,numbers of nerves and ICC were increased,and network was recoveried.

Yang Ming Fu Shi Sydrom; ICC;entric nerve

10.11724/jdmu.2013.06.03

R4

A

1671-7295(2013)06-0520-06

梁国刚，谢明征，曹万龙，等.阳明腑实证大鼠小肠神经-ICC网络形态学损伤和下法施治研究[J].大连医科大学学报，2013,35(6)：520-525.

国家自然科学基金项目(33772860)；辽宁省科技厅项目(2011225030)

梁国刚(1967-),男，辽宁大连人，教授。E-mail：anniu@163.com

齐清会，教授。E-mail：qiqh@medmail.com.cn

2013-10-10；

2013-11-02)