AOPP对ECV304细胞表达SDF-1α的影响及其可能的机制

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(1.大连医科大学 附属第一医院 干部综合科，辽宁 大连 116011；2.大连医科大学 附属第一医院 心内科，辽宁 大连 116011 )

基础医学

AOPP对ECV304细胞表达SDF-1α的影响及其可能的机制

魏明丽1,丁怀玉2,吕田1,李真1,于红玖1,王梅1,马裴裴1

(1.大连医科大学 附属第一医院 干部综合科，辽宁 大连 116011；2.大连医科大学 附属第一医院 心内科，辽宁 大连 116011 )

目的观察晚期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein product，AOPP)对内皮细胞表达基质细胞衍生因子-1α(stromal cell derived factor-1 α,SDF-1α)的影响，并探讨其作用机制。方法ECV304细胞分别经0,50,100,200 μmol/L AOPP处理后，用RT-PCR法检测其SDF-1α mRNA的表达，观察AOPP对ECV304细胞的SDF-1α表达的影响。ECV304细胞先经NF-κB通路特异性阻断剂BAY11-7082处理，再经AOPP处理，用RT-PCR法检测其SDF-1α mRNA的表达，观察BAY11-7082对AOPP促ECV304 细胞SDF-1α mRNA 表达作用的影响。结果AOPP促进ECV304 细胞SDF-1α mRNA 表达，并且随AOPP浓度的升高，SDF-1α mRNA 的表达增加。对照组、AOPP 50 μmol/L组、AOPP 100 μmol/L组及AOPP 200 μmol/L组SDF-1α mRNA/GAPDH mRNA值分别为0.034±0.005、0.109±0.019、0.226±0.037及0.322±0.043，组间比较差异均有显著性意义，P<0.05。BAY11-7082抑制AOPP促ECV304细胞SDF-1α mRNA 表达，两组细胞SDF-1α mRNA/GAPDH mRNA值分别为0.256±0.035和0.322±0.043，P<0.05。结论AOPP可上调ECV304细胞表达SDF-1α，NF-κB通路可能是介导这一作用的重要途径之一。

晚期氧化蛋白产物；基质细胞衍生因子-1α；NF-κB

晚期氧化蛋白产物(Advanced oxidation protein products，AOPP)[1]被认为是体内各种蛋白质受到氧化损伤所生成的终末产物的总称，是随着慢性肾功能衰竭、动脉粥样硬化等氧化应激相关疾病[2]的发生发展而聚集于患者血浆和组织中的一组性质各异的分子。基质细胞衍生因子1α(stromal cell derived factor-1α,SDF-1α)是由基质细胞产生的一种趋化蛋白，将其归为CXC亚家族， SDF-1α具有强大的趋化功能[3]。CXCR4是SDF-1α的特异性受体，在血细胞生成、肿瘤转移及HIV感染等过程中起着重要作用。最近的研究表明SDF-1α/CXCR4 在动脉粥样硬化斑块中高表达[4],且CXCR4 在动脉粥样硬化形成过程有关的主要细胞成分如单核细胞、淋巴细胞、内皮祖细胞、平滑肌祖细胞等中均有表达,因此SDF-1α/CXCR4 与动脉粥样硬化的关系已经引起重视。本研究旨在探讨AOPP对内皮细胞表达SDF-1α的影响。

1 材料和方法

1.1 细胞株

人脐静脉内皮细胞株ECV304由大连医科大学附属第一医院中心实验室提供。

1.2 主要药品试剂

TAKARA RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0购自TAKARA公司； RPMI1640购自GIBCO 公司；胎牛血清购自杭州四季青生物技术公司；无内毒素牛血清白蛋白(BSA)购自SIGMA公司。

1.3 细胞培养

ECV304细胞常规培养于37 ℃，5%CO2，湿润的恒温孵箱中，培养液为含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基，取第3～5代用于实验。实验前，细胞均经过12 h无血清培养。 加入BSA、0、50、100、200 μmol/L的AOPP处理24 h后观察SDF-1α表达的改变。

1.4 AOPP-BSA的制备

以 0.01 mol/L PBS(pH 7.4)将 BSA 溶解至 200 mg/mL，将 NaOCl 溶液稀释至0.2 mol/L(新鲜配制)，各取等量混合(即以 1∶60 摩尔比混合)，室温孵育 30 min，转移至透析袋内，4 ℃对 0.01 mol/L PBS(pH 7.4)透析 24 h以去除 NaOCl，每 4～6 h更换透析液1次，按碘量法检测透析液中的 NaOCl，直至透析液中无 NaOCl，得到AOPP-BSA，0.22 μm 硝酸纤维素膜过滤消毒，分装后-70 ℃冻存。以紫外分光光度计法，于酸性条件下、340 nm 测定AOPP-BSA粗纯品和对照 BSA 样品中 AOPP 的浓度，以氯胺-T(碘化钾存在时最大吸收波长为 340 nm)为标准品，实际测定的为 AOPP 对氯胺-T 的相对浓度[1]。空白管、标准管、测定管及对照管分别含 100 μL PBS、氯胺-T(0～100 μmol/L)、AOPP-HSA(PBS 1∶50 稀释)及对照 BSA，各管加入 5 μL 1.16 mol/L 碘化钾，静置 2 min，再加入 10 μL醋酸，混匀后立即于 340 nm 测定吸光度。以氯胺-T 的浓度和吸光度制作标准曲线，从而查出测定和对照样品中 AOPP 的相对浓度(μmol/L)。应用细菌内毒素(Lipopolysaccharide，LPS)定量测定系统(鲎试剂动态浊度法)进行检测。

1.5 细胞分组及实验

实验一：分别将0,50,100,200 μmol/L AOPP处理后的ECV304细胞，加入Trizol 试剂提取细胞总RNA,并逆转录合成cDNA,再对逆转录产物进行PCR 循环。其中0 μmol/L AOPP处理后的ECV304细胞组作为对照组。比较不同浓度的AOPP对ECV304 细胞SDF-1α mRNA 表达的影响。反应条件：94 ℃预变性5 min后94 ℃变性30 s→58 ℃退火45 s→72 ℃延伸1 min，28个循环后，72 ℃延伸10 min。SDF-1α引物：Sense 5’-AAG CCC GTC AGC CTG AGC TAC-3’，Antisense 5’-AGT TAT CTA CAT CTT GAA CCT CT-3’，预计扩增产物全长495 bp。GAPDH(内参)引物：Sense 5’-TCA CCA TCT TCC AGG AGC GAG-3’，Antisense 5’-TGT CGC TGT TGA AGT CAG AG-3’，预计扩增产物全长697 bp。反应结束后,反应产物进行1.5% 琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,凝胶成像系统采集电泳结果，并应用附带软件分析目标条带与内参条带吸光度值之比，进行半定量PCR。

实验二：将ECV304 细胞分两组,即抑制剂组与非抑制剂组。其中抑制剂组在含20 μmol/L NF-κB抑制剂BAY11-7082 的培养基孵育1 h,之后吸出上述培养基,以无血清培养基洗涤细胞1次,再加入含200 μmol/L AOPP的RPMI 1640 培养液孵育24 h,收集上清液。非抑制剂组直接加入含200 μmol/L AOPP 的RPMI 1640 培养液孵育24 h,收集上清液。按上述方法检测两组细胞SDF-1α mRNA表达情况。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 AOPP 对ECV304 细胞SDF-1α mRNA 表达的影响

与对照组(AOPP浓度为 0 μmol/ L)比较,不同浓度的AOPP (50 μmol/ L,100 μmol/L,200 μmol/L)均升高SDF-1α mRNA 的表达(均有P<0.05)。并且随AOPP浓度的增加，SDF-1α mRNA 的表达进一步升高(图1，表1)。

图1 RT-PCR检测ECV304细胞经0、50、100、200 μmol/L的AOPP处理24 h后的扩增产物电泳

Fig 1 SDF-1α -RT-PCR amplification product electrophoresis in ECV304 cells incubated with different concentrations of AOPP

表1不同浓度AOPP对SDF-1α表达的影响

Tab 1 The expression of SDF-1α was was up-regulated by AOPP in a concentration-dependent manner (n=6)

组别SDF-1αmRNA/GAPDHmRNA对照组0．034±0．005AOPP50μmol/L组0．109±0．019AOPP100μmol/L组0．226±0．037AOPP200μmol/L组0．322±0．043

各组间比较，均P<0.05

2.2 NF-κB通路阻断剂BAY 11-7082抑制AOPP促ECV304 细胞SDF-1α mRNA 表达作用

抑制剂组细胞SDF-1α mRNA/GAPDH mRNA值明显低于非抑制剂组细胞(分别为0.256±0.035和0.322±0.043，P<0.05)(图2)。

图2 两组细胞扩增产物电泳

3 讨 论

动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)被公认为是一种复杂的慢性炎性病变,众多的趋化因子、粘附分子及细胞因子参与其中[5]。血管内皮细胞对于维持血管正常的生理状态具有重要的意义，内皮细胞的功能受到损害或被扰乱都可能影响动脉粥样硬化的发生发展[6]，内皮细胞表达粘附分子并与单核细胞发生粘附是内皮细胞功能受损而处于激活状态的表现之一。基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1 alpha,SDF-1α)是一种强趋化因子,其对T细胞的趋化活性比单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)和巨噬细胞炎性蛋白1(macrophage inflammatory protein-1,MIP-1)高10倍,且SDF 1α能介导血液中的炎性细胞与内皮细胞的粘附及向内膜下迁移。近来动物水平的研究结果提示SDF-1α/CXCR4轴与动脉粥样硬化性疾病密切相关[3,7]。

AOPP是Witko-Sarsat 等[1]于1996年报道由尿毒症血液透析(hemodialysis，HD)患者血浆中分离出的含有双酪氨酸结构的蛋白交联产物，是体内各种蛋白质受到氧化损伤所生成的终末产物的总称，是随着慢性肾功能衰竭(chronic renal failure，CRF)、动脉粥样硬化(atheroscleosis，AS)等氧化应激相关疾病的发生发展而聚集于患者血浆和组织中的一组性质各异的分子。AOPP是通过氯化氧化反应在氧化应激过程由吞噬细胞激活生成的次氧酸或氯胺对血清白蛋白氧化作用生成的含双酪氨酸的蛋白交连物。已知分叶核中性粒细胞和单核细胞在适宜的刺激下能够产生呼吸爆发,而后者可以导致高活性的活性氧(reactiveoxygen species,ROS)大量产生。在ROS的形成中,吞噬细胞具有在髓过氧化酶的作用下生成含氯氧化物能力。髓过氧化酶在氯离子存在的情况下,使过氧化氢生成次氯酸。次氯酸是吞噬细胞所产生的毒性最强和化学性质最活泼的一类物质，AOPP是氯氧化物和血浆蛋白之间的反应产物。目前，一些实验结果提示AOPP通过氧化修饰LDL，形成的AOPP-LDL能显著地活化单核/巨噬细胞，进而促进AS的发生发展。但是AOPP是否通过直接刺激其他粘附因子的表达，从而促进单核细胞趋化，及其与内皮细胞的粘附，加速AS的发生发展，目前，这方面的研究较少。

本实验在ECV304细胞中检测到低水平的SDF-1α表达，但经过AOPP处理后，SDF-1α的表达明显上调，而且其上调的程度随AOPP浓度的增加明显提高。然而AOPP促进ECV304细胞SDF-1α的表达机制仍然不清楚。 本实验发现AOPP促ECV304 细胞SDF-1αmRNA表达的作用可被NF-κB通路特异性阻断剂BAY11-7082抑制，表明NF-κB通路可能是介导AOPP上调ECV304细胞表达SDF-1α这一作用的重要途径之一。当然，还有其他更多的机制参与其中[8-9]，尚需要进一步深入的研究。

[1] Witko-Sarsat V,Friedlander M,Capeillere-Blandin C,et al. Advanced oxidation protein products as a novel marker of oxidative stress in uremia[J]. Kidney Int，1996， 49(5): 1304-1313.

[2] Valente AJ,Yoshidal T,Clark RA,et al. Advanced oxidation protein products induce cardiomyocyte death via Nox2/Rac1/superoxide-dependent TRAF3IP2/JNK signaling[J]. Free Radic Biol Med,2013,60:125-135.

[3] 吕运成，王佐.基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1 alpha， SDF-1α)及其特异受体CXCR4与动脉皱样硬化[J].中国动脉硬化杂志，2005，13(4)：523-525.

[4] Braunersreuther V,Mach F,Steffens S. The specific role of chemokines in atherosclerosis [J]. Thromb Haemost,2007,97(5):714-721.

[5] Zernecke A,Shagdarsuren E,Weber C. Chemokines in atherosclerosis: an update[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2008,28(11): 1897-1908.

[6] 李志，刘卫红，徐维家.内皮损伤在血管性疾病发生发展中的作用[J].大连医科大学学报，2009,31(2)：219-223.

[7] Lee KW,Johnson NR,Gao J,et al. Human progenitor cell recruitment via SDF-1α coacervate-laden PGS vascular grafts[J]. Biomaterials,2013,34(38):9877-9885.

[8] Przyklenk K. 'Going out on a limb': SDF-1α/CXCR4 signaling as a mechanism of remote ischemic preconditioning? [J]. Basic Res Cardiol,2013,108(5):382.

[9] Guo ZJ,Niu HX,Hou FF,et al. Advanced oxidation protein products activate vascular endothelial cells via a RAGE-mediated signaling pathway[J]. Antioxid Redox Signal,2008,10(10):1699-1712.

Effectsofadvancedoxidationproteinproductsonexpressionsofstromalcellderivedfactor-1αinECV304cellsandthepossiblemechanism

WEIMing-li1,DINGHuai-yu2,LVTian1,LIZhen1,YUHong-jiu1,WANGMei1,MAPei-pei1

(1.ComprehensiveDepartmentofCadres,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China; 2.CardiovascularDepartment,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China)

ObjectiveTo observe the effect of advanced oxidation protein product (AOPP) on the expression of SDF-1α in ECV304 cells，and to investigate the possible mechanism.MethodsSDF-1α mRNA expressions were revealed by RT-PCR respectively in ECV304 cells preincubated with different concentrations of AOPP. SDF-1α mRNA expression was revealed by RT-PCR in ECV304 cells preincubated with BAY11-7082 which was a inhibitor of NF-κB signal transduction pathway.ResultsSDF-1α expression was constitutionally detected in ECV304 cells and was up-regulated by AOPP in a concentration-dependent manner. The promoting effect of AOPP on the expression of SDF-1α in ECV304 cells could be inhibited by BAY11-7082.ConclusionAOPP could up-regulate SDF-1α expression in ECV304 cells by NF-κB signal transduction pathway.

advanced oxidation protein products; stromal cell derived factor-1α; NF-κB

10.11724/jdmu.2013.06.08

R54

A

1671-7295(2013)06-0543-04

魏明丽,丁怀玉,吕田,等. AOPP对ECV304细胞表达SDF-1α的影响及其可能的机制[J].大连医科大学学报，2013,35(6):543-546.

魏明丽(1981-)，女，辽宁大连人，主治医师，硕士。E-mail：wml810120@hotmail.com

丁怀玉，主治医师。E-mail：dhy791211@hotmail.com

2013-08-28；

2013-10-30)