与多花黑麦草株高性状相关的RAPD标记分析

张晓佩 高承芳 李文杨 刘 远 董晓宁

（福建省农业科学院畜牧兽医研究所 福州 350013）

多花黑麦草（Lolium multiflorum）又名意大利黑麦草、一年生黑麦草，是一年生或者越年生禾本科植物，原产地中海沿岸[1]，是优良的牧草和草坪草。作为牧草具有生长快、产草量高、营养价值高、适口性好等优点，适用于饲喂各种畜、禽、鱼。它也可以作为先锋草种和保护草种用于草坪。近年来，多花黑麦草在我国栽培的面积日益扩大，尤其是在我国长江流域及其以南地区。

RAPD标记技术已经广泛用于植物的遗传多样性、图谱构建、品种鉴定、基因定位、分子标记辅助育种等研究[2-3]。目前RAPD标记技术主要用于多花黑麦草遗传多样性和品种资源研究[4-6]。本研究初次进行与株高性状相关的RAPD标记分析，旨在为多花黑麦草育种提供分子学方面的基本资料。

1 材料与方法

1.1 材料 选用多花黑麦草品种资源4份：美克斯、海克里斯、剑宝和特高，由百绿公司北京分公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取 基因组DNA提取采用改进CTAB法[7]，最后测基因组DNA浓度，并用0.1×TE稀释到终浓度100 ng/mL。放在-20℃的冰箱中保存备用。

按照每个品种取25个个体DNA的数量，经过测DNA浓度后，稀释成等浓度后等量混合，制成品种的混合DNA（池DNA），用随机引物进行扩增分析。

1.2.2 株高数据记录 黑麦草的株高数据来自试验田记录（取群体均值）。株高测量方法：测定地面到最高叶片尖端的垂直高度。在出苗后生长第60 d（即营养生长期），每个品种随机取20株测量垂直高度，植株各垂直高度的算术平均值为测定植株的高度。1.2.3 RAPD扩增及检测 从110条随机引物中筛选出68条，用该68条随机引物分别对4个黑麦草品种进行PCR扩增，最后筛选出23条多态性高、重复性好的随机引物（如表1），对所有的4个黑麦草品种进行PCR扩增，PCR反应体系为 20μL：10×buffer 2.0 μL，MgC122.0 μL，25 mmo1/L dNTP 2.0 μL，TaqDNA聚合酶1 U，引物1μL，总DNA 100 ng和ddH2O 12μL。扩增反应程序为95℃预变性5 min，然后进入循环，每个循环为95℃变性1 min，36℃退火2 min，72℃延伸1.5 min，共46个循环，最后72℃再延伸10 min。反应产物在1.5%琼脂糖凝胶上检测，电压120 V，电泳25 min，用BIO-RAD Ge1 Doc 2000凝胶成像系统记录拍照。

1.2.4 数据分析 同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性，属于同一位点的产物按扩增阳性（1）或扩增阴性（2）记录电泳带谱，利用SASSystem进行多态性标记的t检验，以获得与株高性状紧密连锁的分子标记，显著水准P＜0.05。多态频率用多态带数目与扩增出所有主带的比率表示。

2 结果分析与讨论

2.1 引物筛选与RAPD扩增结果 最后用于4种多花黑麦草基因组DNA的RAPD扩增的23条引物扩增结果重复率高、扩增条带多态性好，扩增结果见表1、图1。不同引物和不同多花黑麦草品种基因组DNA引起扩增的条带数目不同，数目变化在4～12个，多态性位点的比例为75%～100%。总之，从110条中筛选出的23条引物，共扩增出174条带，其中多态性条带有166个，因此，多态性位点占的比例是95.4%。结果说明，多花黑麦草基因组DNA多态性非常丰富。

2.2 与株高性状相关性分析 把研究群体按照标记基因型的种类不同分成两种类型，即1型和2型，对不同标记基因型的株高性状进行方差分析，得到株高性状与多个标记之间的相关值。方差分析结果表明：在23条引物中有6条特异性标记条带，分布在5条引物中，与多花黑麦草的株高性状呈现出显著相关（P ＜0.05）。从表 2中可以看出：S04-6、S15-3、S50-5、S50-8、S67-2、S99-7 等 6 条特异性标记带与多花黑麦草株高性状有着显著的相关。

表1 引物序列和扩增结果

图1 部分引物扩增结果

由以上结果可以看出，研究中用23条引物共扩增了166个特异性条带，但经过t检验，与目标性状(株高)相关的标记仅有6个，说明166个特异性条带所代表的位点控制着更多的性状，并不仅限于株高。

表2 RAPD标记类型与株高的关联分析

从t检验结果可以看出，6个标记中有基因1型大于基因2型的，也有基因2型大于基因1型的，说明对多花黑麦草株高性状来讲，有3个标记是增效的，有3个标记是减效的。选择有增效标记的个体留种可以增加选种的准确性，加快黑麦草育种的进程，因此，这些分子标记辅助选择育种对于黑麦草的育种十分有意义。

3 小结

1）用基因组DNA作RAPD检测多花黑麦草株高性状位点的方法是可行的，本研究筛选出了23个随机引物对4个多花黑麦草品种的基因组DNA进行扩增，共得到174条带，其中166条带为多态性条带，标记率为95.4%。

2）用RAPD技术检测出了4个多花黑麦草品种基因组DNA的6个株高性状的标记（分布在5条引物中），它们是 S04-6、S15-3、S50-5、S50-8、S67-2、S99-7等。

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