微波辅助提取瑞香狼毒总黄酮工艺条件的优化*

龚 磊，黄小容，龚其海，许 洁，颉江敏 ，李玲如

1)遵义医学院附属医院药剂科遵义563003 2)遵义医学院药理学教研室遵义563003 3)遵义医学院预防医学教研室遵义563003 4)遵义医学院药学院 遵义563003 5)遵义医学院药物制剂2008 届毕业生 遵义563003

#通讯作者，男，1944年5月生，教授，研究方向:药物化学和天然产物化学，E-mail:jiejiangmin@vip.sohu.com

瑞香狼毒(stellera chamaejasme L.)为瑞香科狼毒属植物，又名红狼毒、棉大戟、断肠草等，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌和抗结核的作用等。瑞香狼毒总黄酮是从瑞香狼毒中提取的一种重要组分，具有抗肿瘤作用［］。近年来，微波技术在天然植物的有效成分提取中得到了广泛应用，具有设备简单、节省时间、投资少、适用范围广、提取效率高、重现性好、节省试剂且污染小等优点［2-3］。作者应用微波辅助提取瑞香狼毒总黄酮，采用正交实验设计的方法分别对料液比、溶剂浓度、微波功率及提取时间4 个因素进行考察，以期得到微波辅助提取最佳工艺条件，为进一步深入开发和利用瑞香狼毒提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 药材、试剂及仪器 瑞香狼毒由兰州市药材供应站提供，经河南省南阳市药监所黄海欧副教授鉴定为瑞香科植物瑞香狼毒(stellera chamaejasme L.);槲皮素标准品为上海化学试剂公司产品;体积分数95%乙醇、甲醇等均为分析纯。JA1003N 型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，XH-100A 电脑微波催化合成/萃取仪(北京祥鹄科技发展有限公司)，UV-2550 型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)。

1.2 瑞香狼毒总黄酮微波辅助提取方法的建立

1.2.1 瑞香狼毒样品液的制备 称取5.000 g 瑞香狼毒原料，经体积分数95%乙醇微波辅助提取后，挥发溶剂得浸膏，经甲醇溶解，定容到50 mL 容量瓶中，取0.2 mL 溶液稀释到25 mL，取2 mL 稀释液加甲醇定容到10 mL 即得瑞香狼毒样品液。原料在微波辐射前均需用相应提取溶剂预浸泡2 h，使溶剂充分浸透原料，利于吸收微波辐射。

1.2.2 总黄酮含量的测定 以槲皮素标准品为对照品，采用紫外-可见分光光度法进行测定。精密称取110℃干燥恒重的对照品2.002 mg，用甲醇定容于50 mL 容量瓶中，取0.2 mL 溶液到25 mL 容量瓶，加甲醇稀释，定容，得质量浓度为0.32 mg/L 的标准溶液。精密量取上述标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分别置于10 mL 容量瓶，定容，依次在298 nm 波长处测定吸光度。以吸光度(A)对质量浓度(C)作直线回归，回归方程为A=0.098 56 C+0.090 04(r=0.999 6)，以此方程测算样品液总黄酮含量。

1.3 实验条件的优选

1.3.1 单因素实验条件 选择对瑞香狼毒总黄酮得率有影响的4 个因素，即料液比(A)、乙醇浓度(B)、微波功率(C)和提取时间(D)进行单因素实验。①设定乙醇浓度(体积分数90%)、微波功率(800 W)、提取时间(60 s)，选择5 种料液体积比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)。②设定料液比(1:20)、微波功率(800 W)、提取时间(60 s)，分别选择体积分数为50%、60%、70%、80%和90%的乙醇作为溶剂。③设定乙醇浓度(体积分数90%)、料液比(1:20)、提取时间(60 s)，选择5 种不同微波功率(500、600、700、800 和900 W)。④设定乙醇浓度(体积分数90%)、料液比(1:20)、微波功率(800 W)，选择5 种提取时间(30、60、90、120 和150 s)。在上述条件下按1.2 法进行瑞香狼毒总黄酮的提取，计算总黄酮得率。

1.3.2 正交实验设计 根据单因素实验结果，选择上述4 个因素的较优水平，按L9(34)设计进行正交实验。

2 结果

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对总黄酮得率的影响 在选定其他3 个因素水平的条件下，以不同料液比进行实验，总黄酮得率见表1。

表1 不同料液比条件下总黄酮得率(n=3)

2.1.2 乙醇浓度对总黄酮得率的影响 在选定其他3 个因素水平的条件下，以不同体积分数的乙醇作为溶剂，总黄酮得率见表2。

表2 不同乙醇浓度条件下总黄酮的得率(n=3)

2.1.3 微波功率对总黄酮得率的影响 在选定其他3 个因素水平的条件下，以不同微波功率进行提取，总黄酮得率见表3。

2.1.4 提取时间对总黄酮得率的影响 在选定其他3 个因素水平的条件下，以不同提取时间进行提取，总黄酮得率见表4。

2.2 正交实验结果 正交实验因素水平表见表5，结果见表6和7。可以看出，对瑞香狼毒总黄酮得率的影响大小依次为:乙醇浓度(B)＞微波功率(C)＞料液比(A)＞提取时间(D)。微波萃取的优化工艺条件是B3C3A2D3，即乙醇体积分数为90%，提取时间60 s，料液比1:25，微波功率900 W。按此工艺条件下进行了3 次验证实验，总黄酮得率分别为33.232，33.157 和33.163 mg/g，平均33.184 mg/g。

表3 不同微波功率条件下总黄酮得率(n=3)

表4 不同提取时间条件下总黄酮得率(n=3)

表5 L9(34)正交实验的因素水平

表6 L9(34)正交实验结果

表7 正交实验方差分析表

3 讨论

微波辅助提取技术较传统提取技术具有提取效率高的明显优点［4］。在瑞香狼毒中，黄酮类成分含量较高，黄酮类化合物热稳定性较好，极性较大，适宜于微波辅助萃取技术。

该研究以总黄酮得率为考察指标，探讨了溶剂乙醇浓度、料液比、微波功率和提取时间对瑞香狼毒总黄酮提取结果的影响。结果显示，上述4 个因素对总黄酮得率均有很大影响。因为溶剂极性随乙醇浓度的增大而减小，极性大的溶剂吸收了大部分微波能，而药材没有足够的微波能吸收，所以随着溶剂极性的增加，总黄酮的得率反而减小。当料液比小于1:25时，随着料液比的增大，总黄酮得率不断增大，其原因是:提取液体积越大，溶剂与浸提物的接触越充分，在相同时间内能溶解出更多的黄酮类化合物，使得率增大［5］。当料液比大于1:25 时，得率变化并不显著，说明黄酮类化合物溶解基本饱和。当微波功率设定在500～800 W时，随着功率的增大，得率增大，原因主要是:天然黄酮的萃取温度由黄酮的热敏性决定，微波功率和萃取温度成正相关，在萃取时间固定时，萃取温度随着微波功率的增大而升高，细胞壁裂解率增高，细胞内吸收微波能的极性分子易溶出。在800～900 W 时，随着微波功率的增大，总黄酮得率逐渐下降，这是因为温度过高引起蛋白等不耐热的成分糊化，造成黄酮类成分的黏附，从而导致得率降低。作者还观察到，得率随提取时间的延长而明显增大，当提取时间大于60 s 时，得率明显下降。

在单因素实验基础上，作者采用正交实验确定了微波辅助提取瑞香狼毒总黄酮的最佳工艺条件。实验结果表明，最佳工艺条件为料液比1:25，乙醇体积分数90%，微波功率900 W，提取时间60 s。在此条件下总黄酮平均得率为33.184 mg/g，该方法简单、易行，且快速、节能，值得推广应用。

［1］王敏，贾正平，马骏，等.瑞香狼毒总黄酮提取物的抗肿瘤作用［J］.中国中药杂志，2005，30(8):603

［2］冯年平，范广平，韩朝阳.中药提取技术研究进展［J］.中国中医药信息杂志，2000，7 (10):15

［3］元英进，刘明言，董岸杰.中药现代化生产关键技术［M］.北京:化学工业出版社，2002

［4］张卫强，邓宇.微波辐射技术在天然物活性成分萃取中的应用［J］.化学工业与工程技术，2001，22(6):1

［5］王志刚，秦明坚，郝利君，等.超声波提取菝葜中总黄酮的正交实验研究［J］.中国野生植物资源，2009，28(5):54