六种肿瘤相关抗原自身抗体联合CA125检测对卵巢癌早期诊断的价值*

李留霞 ，张兰兰，李秀芳，张建营，王凯娟，代丽萍，王 鹏，张 毅

1)郑州大学第一附属医院妇产科 郑州450052 2)郑州大学公共卫生学院;郑州大学蛋白质组学应用研究中心 郑州450001 3)郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心;郑州大学生物工程系 郑州450052

#通讯作者，女，1962年6月生，博士，教授，主任医师，研究方向:妇科肿瘤、妇科内分泌疾病及不孕不育，E-mail:llxia698@163.com

卵巢癌(ovarian cancer，OC)病死率居妇科恶性肿瘤之首，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌，位居第3［1］。目前协助诊断卵巢癌的肿瘤标志物主要是血清CA125，但其敏感性和特异性均不理想，尤其是对早期卵巢癌诊断价值不大。研究［2-4］发现肿瘤患者血清中存在各种类型的抗肿瘤细胞自身抗原的抗体，这些与肿瘤发生有关的抗原被称为肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)。有研究［5-8］显示P53、Survivin、IMP1、Cyclin D1、C-myc 和Cyclin E 在OC组织中呈现高表达，理论上推测这些抗原应该能刺激机体产生特异性抗体。该研究通过对卵巢癌患者血清中上述6 种TAAs 抗体及CA125 进行检测，探讨TAAs 抗体联合CA125 检测对诊断早期卵巢癌的应用价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料 该研究中使用的血清标本来自2011年1月至2012年1月在郑州大学第一附属医院、郑州大学第三附属医院首次住院治疗的卵巢肿瘤患者，经知情同意后收集血清，立即冻存于－20℃冰箱，所有病例均经术后组织病理学证实。①OC组78例，患者年龄23～79 岁;包括浆液性囊腺癌63例，黏液性囊腺癌15例;FIGO 临床分期:Ⅰ、Ⅱ期28例，Ⅲ、Ⅳ期50例。②卵巢良性上皮性肿瘤组60例，患者年龄26～71 岁。③正常对照组血清100例，采集于在郑州大学第一附属医院进行健康体检并证实无任何肿瘤相关疾患的健康女性，年龄21～65 岁。

1.2 主要试剂及仪器 P53、Survivin、IMP1、Cyclin D1、C-myc 和Cyclin E 抗体由美国德克萨斯州大学生命科学系肿瘤免疫和肿瘤分子流行病学研究室提供。96 孔酶标板系Gibico 公司产品。酶标仪为美国Tecan 公司Sunrise 酶标仪。其他试剂如过氧化氢尿素显色液(TMB)、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(HRP-APS)等均由郑州大学蛋白质组学应用研究中心馈赠。

1.3 6 种TAAs 抗体的ELISA 法检测 采用Zhang 等［9-15］建立的间接ELISA 法:将各种抗原以0.5 g/L 的质量浓度包被96 孔板;一抗与待测血清按1:100 稀释，PBS 作为空白对照，每孔加100 μL，37℃孵育1 h，PBST 洗板3 次;二抗辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A 蛋白(HRP-APS，按1:4 000 稀释)，每孔100 μL，37℃孵育1 h，PBST 洗板3 次，PBS 洗板1 次;每孔加入TMB 显色液100 μL，37℃避光反应至充分显色;加终止液50 μL，立即在自动酶标仪上读取450 nm 吸光度(A)值，空白孔调零。结果判定:样品血清每份做2 孔，取平均值判断结果，空白孔调零;选择7 个正常血清和2 个卵巢癌患者血清作为判断每批ELISA 试验之间可靠性的指标;100例正常人血清A 值的平均值加2 个标准差为判断临界值，即截断值，高于此值为阳性，低于此值为阴性。

1.4 CA125 的测定 采用电化学发光免疫测定法(ECLIA)，按说明书提供的实验程序检测血清CA125 的水平。仪器:德国宝灵曼公司Elecsys 2010全自动免疫分析仪。检测指标采用正常值上限，即CA125 ＞35 kU/L 为阳性。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0 进行分析，应用χ2检验及精确概率法分析不同组合间各种率的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 6 种TAAs 抗体原的检测结果及真实性评价见表1。由表1可知，卵巢癌患者血清中每种TAA抗体阳性率均明显高于正常人血清。这6 种TAAs的抗体阳性率最低为11.5%，最高为35.9%。而正常人抗体阳性率均较低，为2.0%～6.0%。

2.2 不同TAAs 抗体组合的检测结果及评价 见表2。6 种TAAs 联合CA125 检测时其约登指数为0.722，阳性似然比为4.01，阴性似然比为0.05，一致率为84.83%，Kappa 值为0.701。

表1 6 种TAAs 抗体的检测结果及真实性评价

2.3 6 种TAAs 抗体联合CA125 检测的结果及综合性评价 见表3、4。由表3可知，CA125 阴性的10例早期卵巢癌患者中，6 种TAAs 抗体联合检测阳性者为7例。6 种TAAs 联合CA125 检测对早期卵巢癌的检测阳性率明显高于单独应用CA125 检测的阳性率，两者差异有统计学意义(χ2=4.909，P=0.027)。由表4可知，6 种TAAs 联合CA125 检测对卵巢癌的检测阳性率明显高于卵巢良性肿瘤组和正常对照组。

表2 不同TAA 抗体组合的检测结果评价

表3 不同分期卵巢癌患者中TAAs 抗体及CA125 的检测结果 阳性例数(%)

表4 3组对象6 种TAAs 抗体联合CA125 检测结果分析

3 讨论

肿瘤标志物由肿瘤组织自身产生，是一类可反映肿瘤存在和生长的生化物质，它对于肿瘤的早期发现、病情监测及靶向性治疗具有重要意义。卵巢癌患者死亡率居妇科恶性肿瘤之首，其总体5 a 生存率为45%，且其发病率呈上升趋势［14］。在普通女性人群中，发生卵巢癌的风险为1.4%，而在某些高危妇女中风险更高。由于大多数卵巢癌临床诊断时已处于晚期，迫切需要一种能够早期临床诊断的方法。虽然目前已经找到了一些肿瘤标记物，而且在超声辅助下可明显增加诊断的灵敏度和特异性，但仍未达到满意结果［16］。

在卵巢癌细胞中CA125 有高度表达，并能分泌入血液，目前已作为一种常规的血清标志物应用于卵巢癌患者的病情监测，并已成为临床上应用最广的卵巢癌肿瘤标志物，但由于在排卵期、子宫内膜异位症、子宫肌瘤、盆腔炎症等生理及病理情况下也会导致CA125 升高，所以应用CA125 诊断卵巢癌的特异性不高，而且早期卵巢癌CA125 检测阳性率仅27%～66%［16］。有学者［17］提出采用TAAs 抗体作为血清标志物来诊断癌症，但是研究结果显示单个TAAs 抗体检测的灵敏度比较低，一般为10%～30%，不宜作为临床检测指标，Zhang［9-15］等采用精心筛选出的TAAs 抗体联合检测，可使检测的灵敏度提高到63.6%。

该研究选取6 种TAAs 抗体联合CA125 来检测卵巢癌，结果显示单个抗体检测的灵敏度较低，而联合检测可显著提高检测的灵敏度，6 种TAAs 联合检测的灵敏度达到55.1%，特异度为87.0%。6 种TAAs 抗体联合CA125 的检测灵敏度为96.2%，特异度为76.0%，该组合检测的阳性似然比为4.01，阴性似然比为0.05，阳性预测值为75.8%，阴性预测值为96.2%，提示该方法的诊断价值较高;Kappa值为0.701，提示该试验的检测结果与真实值高度一致;6 种TAAs 抗体联合CA125 检测对早期卵巢癌的检测阳性率为89.3%，明显高于单独应用CA125 检测的阳性率，表明6 种TAAs 抗体与CA125 联合可弥补CA125 单独应用时诊断早期卵巢癌阳性率较低的不足，起到了互补作用，可望成为早期卵巢癌的诊断方法。

综上所述，采用筛选出的6 种TAAs 抗体联合CA125 检测对卵巢癌的早期诊断可能具有重要的参考价值。

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