不同临床类型HCV感染者外周血CD4+ CD25+调节性T细胞分布比例*

李志勤，王 菲，张 震，王 盟，黄建敏，李建生 ，张 毅

1)郑州大学第一附属医院感染科 郑州450052 2)郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心 郑州450052 3)郑州大学第一附属医院消化内科 郑州450052 4)郑州大学第一附属医院肿瘤科 郑州450052 5)郑州大学生物工程系 郑州450001 6)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州450052

#通讯作者，李建生，男，1955年10月生，博士，教授，研究方向:消化系统疾病的治疗进展，E-mail:lijiansheng@medmail.com.cn;张毅，男，1964年4月生，博士，教授，研究方向:肿瘤免疫学、肿瘤干细胞和生物细胞治疗，E-mail:yizhang@zzu.edu.com

丙型病毒性肝炎呈世界性分布，全球约有1.7亿人感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)，60%～80%的HCV 感染者慢性化发展，30%的丙型病毒性肝炎可发展成为肝硬化、肝癌［1］。有效而持久的T 淋巴细胞反应是HCV 感染后病毒得以清除的重要决定因素［2］。CD4+CD25+调节性T 细胞是机体内具有重要免疫调节功能的CD4+T 淋巴细胞亚群。文献［3-4］报道CD4+CD25+调节性T 细胞参与了HBV、HIV 等多种病毒感染性疾病的发展过程。在HCV 感染所致的不同临床转归中CD4+CD25+调节性T 细胞所起的作用尚不十分清楚。该研究以HCV 感染后不同临床分型的患者为观察对象，分析其外周血中CD4+CD25+调节性T 细胞分布比例的差异，探讨CD4+CD25+调节性T 细胞对于HCV 感染后疾病进程的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2011年6月至2012年6月于郑州大学第一附属医院感染科、消化内科门诊及住院部就诊的59例HCV 感染者。其中慢性丙型肝炎患者35例，男16例，女19例，年龄19～65(42.1±8.4)岁;丙型肝炎肝硬化患者14例，男10例，女4例，年龄42～58(40.1±6.2)岁;HCV 感染后痊愈者10例，男5例，女5例，年龄8～46(36.1±5.3)岁。慢性丙型肝炎患者HCV-IgG、HCV RNA 均阳性;丙型肝炎肝硬化患者均有典型的影像学资料支持诊断;HCV 感染后痊愈者指多次复查均为HCVIgG 阳性，HCV RNA 阴性的感染者，均有应用血制品史、手术史等。病例诊断均符合2004年中华医学会传染病和寄生虫病学分会、肝病学分会联合制订的丙型肝炎防治指南［5］。所有患者抗-HCV 阳性，而甲型、乙型、丁型、戊型肝炎病毒感染血清标志物阴性、排除HIV 感染以及乙醇性肝病等。另选年龄和性别与患者相匹配的健康志愿者33例作为健康对照，男17例，女16例，年龄25～47(38.1±8.2)岁。对照标本由郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心提供。

1.2 外周血CD4+CD25+调节性T 细胞分布比例的检测 CD4-FITC、CD25-PE、FOXP3-APC 抗体及同型对照IgG2α-FITC 和IgG2α-PE、IgG2α-APC 购自德国美天旎公司;Buffer 购自美国Biolegend 公司;淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司)。BD Canto Ⅱ流式细胞仪(美国BD 公司产品)，DIVA软件(BD 公司)用于获取和分析实验数据。所有受试者在清晨空腹状态下自肘静脉留取5 mL 外周静脉血，肝素钠抗凝，采用梯度-密度离心法分离外周血单个核细胞。将分离得到的单个核细胞加入CD4-FITC 抗体、CD25-PE 抗体(同型对照用IgG2α-FITC 和IgG2α-PE)各5 μL，振荡均匀，避光孵育20 min。将破膜剂按照1:1 000 的比例稀释后分别加入存放细胞的EP 管内，避光孵育5 min，1 500 r/min 离心5 min，弃上清。加入FOXP3-APC 抗体及同型对照，振荡均匀后，避光孵育20 min，加入双蒸水，将细胞转移至上样管内，应用BD Canto Ⅱ流式细胞仪检测。

1.3 HCV RNA 载量检测 HCV RNA 载量采用荧光定量PCR 法［6］检测，试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司，检测下限为500 IU/mL。操作严格按照试剂盒和仪器说明书进行。

1.4 统计学处理 应用SPSS 17.0 对于实验数据进行分析。4组间外周血CD4+CD25+调节性T 细胞分布比例比较行单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验，慢性HCV 感染者外周血CD4+CD25+调节性T 细胞分布与HCV RNA 载量相关性采用Pearson 相关性分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组外周血CD4+CD25+调节性T 细胞分布比例比较 见表1。

表1 不同临床类型的HCV 感染及健康者外周血CD4+CD25+调节性T 细胞分布比较 %

2.2 慢性HCV 感染者外周血CD4CD25调节性T 细胞分布与HCV RNA 载量相关性分析 慢性丙型肝炎及丙型肝炎肝硬化患者HCV RNA 载量分别为(6.07±1.07)IU/mL 和(5.71±1.10)IU/mL，外周血CD4+CD25+调节性T 细胞分布比例与HCV RNA 载量呈正相关(r =0.780 和0.870，P =0.021和0.015)。

3 讨论

CD4+CD25+调节性T 细胞的主要作用是抑制T 细胞增殖及维持自身免疫耐受。有研究［6-7］表明，多种病原体的慢性感染都能够诱导宿主外周血CD4+CD25+调节性T 细胞表达上调，去除CD4+CD25+调节性T 细胞能够显著降低这些病原体的感染。于建武等［8］研究表明，伴随胰岛素抵抗的慢性丙型肝炎患者外周血CD4+CD25+调节性T 细胞分布比例随着胰岛素抵抗的加重而降低。也有研究［9］表明CD4+CD25+调节性T 细胞细胞在非乙醇性脂肪肝炎患者的发病机制中起关键作用，可抑制免疫功能，造成该类型患者低度炎症反应及免疫功能紊乱。

作者检测了HCV 感染后不同临床类型患者外周血CD4+CD25+调节性T 细胞的分布，发现HCV感染后痊愈的感染者与健康对照者外周血CD4+CD25+调节性T 细胞分布比例差异无统计学意义，而丙型肝炎肝硬化组高于慢性丙型肝炎组，提示CD4+CD25+调节性T 细胞可能是HCV 感染慢性化进展的重要影响因素之一。将HCV 感染慢性化慢性丙型肝炎患者及丙型肝炎肝硬化的患者外周血CD4+CD25+调节性T 细胞分布比例及HCV RNA载量进行相关性分析，发现2 者呈明显的正相关，推测患者病毒复制招募了大量CD4+CD25+调节性T细胞，抑制CTL 细胞的免疫反应，从而导致机体对于HCV 感染产生免疫耐受，HCV 感染难以清除，病情迁延不愈，甚至发展至丙型肝炎肝硬化。

总之，研究CD4CD25调节性T 细胞在丙型肝炎病程中所发挥的作用将有助于进一步了解丙型肝炎的发病机制，为丙型肝炎的免疫治疗提供新的思路。

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