子宫内膜异位症患者内膜组织中TLR4及MyD88的表达

李 洁，申爱荣，杨春丽，吴 允

郑州大学第三附属医院妇产科 郑州450052

#通讯作者，女，1954年8月生，本科，教授，主任医师，研究方向:子宫内膜异位症，E-mail:shenairong08@163.com

子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)是具有生 长功能的子宫内膜组织碎片出现在子宫腔及子宫肌层以外的其他部位，以痛经和不孕为主要临床症状［1］。EMs 的发病率有逐年上升趋势，其发病机制至今尚未完全阐明。近几年免疫功能的改变与EMs 发病之间的关系受到越来越多的关注。Toll 样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)是一种近年来发现的固有免疫受体，参与固有免疫的关键环节，其免疫调节失衡与多种疾病的发病机制有关。髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)是TLR4 信号通路中的重要转导蛋白，其依赖的信号通路以及调控的基因产物在固有免疫和适应性免疫中均发挥着关键作用［2］。关于TLR4-MyD88 通路与EMs 的关系目前尚未见报道。作者检测了EMs 患者异位及在位内膜组织中TLR4 和MyD88 的表达，以探讨其在临床可能存在的指导意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2011年6月至2012年4月在郑州大学第三附属医院住院并经病理证实为EMs 的患者45例，年龄20～46(30.5±6.9)岁，采用美国生育学会1985年修订的分期标准(r-AFS)进行分期，其中Ⅰ、Ⅱ期15例，Ⅲ、Ⅳ期30例。分别取其异位内膜组织45例为异位内膜组，在位内膜组织30例为在位内膜组;另选取同期因子宫纵隔行宫腔镜手术患者的正常内膜组织30例为对照组，患者年龄21～37(29.0±7.4)岁。所有患者对该研究均知情同意，月经周期规律，术前6 个月未接受激素治疗，排除有子宫腺肌症及肿瘤病史者，均无严重内科合并症。

1.2 主要试剂及仪器 Trizol、RT 试剂盒、PCR 试剂盒及Marker 均购自Transgene 公司，兔抗人MyD88、TLR4 多克隆抗体由北京博奥森生物公司提供，SP 试剂盒、DAB 均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，PCR 扩增仪购自Eppendorf 公司，D-140 图像记录分析系统购自大连Jim-X Scientific 公司。引物由北京博大泰克生物基因技术公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.3 3组中TLR4 和MyD88 mRNA 表达水平的测定 采用半定量RT-PCR 法。Trizol 法提取总RNA，逆转录得cDNA，取2 μL 后续扩增。反应条件为94℃预变性2 min;94℃变性30 s，TLR4、MyD88、β-actin分别于50、55、55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35 个循环;最后72℃总延伸6 min。行EB 染色琼脂糖凝胶电泳，用D-140 图像记录分析系统进行分析，目的基因的表达量以其DNA 条带和β-actin的DNA 条带灰度值的比值表示。

1.4 3组中TLR4 和MyD88 蛋白表达水平的测定采用免疫组化SP 法。严格按照试剂盒说明操作，一抗均按1:50 稀释，4℃过夜后滴加二抗，37℃孵育30 min，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗复合物，DAB 显色，苏木素复染，脱水封片。PBS 代替一抗作为阴性对照。采用ITP 图像分析软件对免疫组化结果进行平均积分光密度值分析。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0 处理数据。采用单因素方差分析比较3组间TLR4 与MyD88 mRNA和蛋白表达水平的差异，组间两两比较采用LSD-t法;采用两独立样本的t 检验比较EMsⅠ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期患者异位内膜组织中TLR4 与MyD88 mRNA 和蛋白表达水平的差异;采用Pearson 相关分析在位内膜组及异位内膜组中TLR4 和MyD88 蛋白与mRNA 表达的相关性。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组中TLR4 与MyD88 mRNA 和蛋白的表达水平 TLR4 和MyD88 蛋白主要在腺体上皮细胞表达，TLR4 蛋白主要表达在细胞胞质和胞膜，MyD88 蛋白主要表达在细胞胞质。间质细胞也有少量表达。3组TLR4 与MyD88 mRNA 和蛋白的表达比较，见图1、图2和表2;TLR4 和MyD88 的mRNA 及蛋白在EMs患者不同分期异位内膜组织中的表达比较，见表3。

图1 各组内膜组织中TLR4(上)及MyD88(下)mRNA 的表达情况

图2 各组内膜组织中TLR4(A)和MyD88(B)蛋白的表达情况(SP，×400)

表2 3 种组织中TLR4 和MyD88 的mRNA 及蛋白表达情况

表3 TLR4 和MyD88 mRNA 及蛋白在不同分期EMs 患者异位内膜组织中的表达情况

2.2 在位内膜组及异位内膜组TLR4 和MyD88 mRNA 及蛋白表达的相关性 在位内膜组TLR4 及MyD88 mRNA 和蛋白的表达水平均呈正相关(r =0.594、0.560，P 均＜0.001);异位内膜组TLR4 及MyD88 mRNA 和蛋白的表达水平亦均呈正相关(r=0.812、0.639，P 均＜0.001)。

3 讨论

3.1 TLR4 与EMs TLRs 是一类病原分子识别受体，可以引发炎症反应和诱导机体获得免疫反应［3-4］。TLR4 是TLRs 中关键的一个分子。赵先兰等［5］研究表明:TLR4 通路可能在子痫前期的发生中起着重要作用。该研究结果显示，TLR4 mRNA 及蛋白在EMs 患者的异位内膜及在位内膜组织中的表达均高于对照组织。推测当宫腔感染时，对照组低表达的TLR4 不能引起强烈的免疫应答，对内膜起保护作用。而EMs 患者的在位内膜组织中TLR4高表达，更易被激活，引起强烈的免疫应答。这也佐证了“在位内膜决定论”［6］。这种作用机制有可能与肠黏膜发生感染的机制相似［7］。此外，EMs 患者异位内膜组织高表达TLR4，因此推测TLR4 与EMs的发病有密切关系。研究［8-9］证实，正常的肠上皮低表达TLR4，使肠上皮对共生菌保持免疫耐受。该实验结果与Allhorn 等［10］的研究结果不相符，其结果表明:EMs 患者的在位内膜组织中TLR3、TLR4 蛋白表达均低于正常内膜组织，而在相对应的宫骶韧带处异位内膜腺上皮表达明显增高。作者推测这可能与统计学误差或种族差异有关。

3.2 MyD88 与EMs 有研究［11］表明，TLR4/MyD88 信号通路在LPS 诱导的牛子宫内膜先天性免疫应答中起着重要作用，敲除基因TLR4 或用siRNA 沉默其信号转导分子MyD88，可减少上皮细胞和间质细胞对LPS 的炎症应答。该研究结果显示，异位内膜组MyD88 mRNA 及蛋白的表达水平均高于在位内膜组及对照组，且在位内膜组的表达水平亦高于对照组。推测MyD88 在TLR4/MyD88 通路中被激活，在EMs 的发生与发展过程中有着重要意义。

3.3 TLR4 与MyD88 的相关性及其在EMs 发病机制中的作用 作者发现，TLR4 和MyD88 在EMs患者异位内膜组织及在位内膜组织均呈高表达，且在在位内膜组织及异位内膜组织中TLR4 与MyD88 mRNA 和蛋白的表达水平均呈正相关。推测TLR4/MyD88 通路在在位内膜被激活，进而产生瀑布式级联反应激活丝裂原激活的蛋白激酶及转录因子核因子-κB 通路，从而使细胞因子、炎症因子、炎症趋化因子、Ⅰ型IFNs 等分泌增加，异常的子宫内膜逆流于腹腔中，其分泌的化学物质有助于黏附、侵袭、血管生成，形成EMs 异位病灶［12-13］。此外，该研究结果还显示，异位组织Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ、Ⅳ期的TLR4 和MyD88 mRNA 和蛋白的表达水平比较，差异无统计学意义，推测TLR4 和MyD88 只参与了EMs 的早期发病但不影响疾病的进展。

综上所述，TLR4/MyD88 在在位内膜及异位内膜组织中高表达，TLR4/MyD88 信号通路可能在EMs 的发病机制中具有重要作用;提示可能可以通过干扰信号转导过程中的某个环节在早期阶段阻止病情进展，为EMs 的治疗提供新的方案。关于TLR4/MyD88 信号通路如何参与EMs 的发病机制还需进一步研究证明。

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