Bcl-2反义核酸对SK-N-SH细胞增殖和凋亡的影响

张艳艳 张晓艳 付旭东 周少龙 王新军△

1）郑州大学基础医学院病理生理学教研室 郑州 450001 2）郑州大学第五附属医院神经外科 郑州 450052

神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）为儿童最常见的颅外肿瘤。传统的治疗手段在一定程度上提高了部分低危NB患儿的生存率，但高危NB患儿的预后仍然不理想。原癌基因Bcl-2最早发现于滤泡性淋巴瘤染色体断端t（14；18），可调节程序性细胞死亡或凋亡。研究发现未经治疗的NB中有1／3表达Bcl-2，而且Bc1-2的高表达与肿瘤的恶性生物学行为和预后不良有密切关系［1］。本研究通过设计Bc1-2反义核酸（antisense oligonucleotides，ASODN），应用脂质体Lipofectamine（Gibco）介导转染人NB细胞株SK-N-SH，考察Bcl-2反义核酸对人NB细胞的生长和凋亡的影响。以期今后对NB患儿的基因治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料 人NB细胞株SK-N-SH购自中国医学科学院。用含有10%优级胎牛血清的DMEM培养基培养，培养条件为5%CO2、37℃。Bcl-2反义核酸ASODN的序列链为5＇-tctcccagcgtgcgccat-3＇，正义链SODN序列为5＇-taccgcgtgcgaccctct-3＇，为上海生工生物工程技术服务有限公司合成；MTT购自Santa Cruz公司；细胞周期和凋亡检测试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司；脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组：实验共分3组Bcl-2反义核酸组（ASODN＋Gibco）、正义核酸组（SODN＋Gibco）、脂质体组（只加Gibco）及空白对照组。ASODN和SODN组：分别加入10 μmol／L ASODN或SODN的培养基中培养。脂质体组：细胞中加入与ASODN和SODN组等体积脂质体培养。

1.2.2 SK-N-SH细胞培养：将SK-N-SH细胞用含有10%胎牛血清，100U／mL青霉素和100U／mL链霉素的DMEM培养基，置于5%CO2、37℃的细胞培养箱内常规培养。所有实验均在细胞的对数生长期进行。

1.2.3 细胞转染：按照LipofectamineTM 2 000说明书进行转染。取对数生长期细胞，调整细胞密度，接种于24孔板，24h细胞贴壁后弃去旧培养液待转染。ASODN与LipofectamineTM 2 000分别用适量不含血清和抗生素的DMEM稀释，5min内将其混合，室温静置20min后加入细胞孔中，置于培养箱常规培养。选用反义核酸与脂质体最佳转染比例为1.0OD∶50μL。

1.2.4 MTT法检测细胞增殖：将各组细胞分别于转染后24、48、72h从培养箱中取出，加入1g／L MTT 20μL，混匀，继续培养4h后，离心后弃上清液，每孔加DMSO 100μL，震荡10min，使结晶完全溶解。MTT法检测各组细胞增殖抑制率。抑制率＝（1-实验组平均A值／对照组平均A值）×100%。

1.3 FCM检测细胞周期 加药培养72h后，6孔板中所有细胞，用PBS洗涤2次，70%的冰乙醇1mL固定细胞置4℃过夜。冰PBS洗涤3次，再加入PI 50μL，标记30min后，上流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

1.4 FCM检测细胞凋亡 加药培养72h后，收集6孔板中所有细胞，按照凋亡检测试剂盒操作，用AnnexinV-FITC／PI双染法上流式细胞仪检测细胞凋亡。以早期凋亡细胞占全部细胞的百分比表示细胞凋亡率。

1.5 统计学分析 用SPSS 15.0统计软件进行单因素方差分析及t检验，结果以均数±标准差（±s）表示。检验的显著性水准为α＝0.05。

2 结果

2.1 Bcl-2反义核酸对SK-N-SH细胞增殖的影响 各组细胞从转染后24～72h的细胞生长抑制率，见表1。ASODN组较空白对照组差异有统计学意义（P＜0.01），其余3组差异均无统计学意义（P＞0.05）。ASODN对SK-N-SH细胞生长的抑制作用随时间的延长而增强。

表1 Bcl-2反义核酸对SK-N-SH细胞不同时间的细胞抑制率 （%，±s）

表1 Bcl-2反义核酸对SK-N-SH细胞不同时间的细胞抑制率 （%，±s）

注：与对照组相比，＊P＜0.001

组别 n 24h 48h 72h对照组6 0 0 0 Gibco组 6 1.68±1.03 2.45±0.96 3.21±1.21 SODN＋Gibco组 6 2.07±1.27 2.84±1.75 3.35±1.02 ASODN＋Gibco组 6 32.13±2.34＊44.09 ±3.26＊68.24 ±2.41 ＊

2.2 Bcl-2反义核酸对SK-N-SH细胞周期和凋亡的影响 FCM检测结果见表2。经Bcl-2反义核酸处理72h后，ASODN组G2／M期的细胞比率（24.8±0.4）%和细胞早期凋亡率（23.25%）较空白对照组明显增加（均P＜0.01）；其余各组与空白对照组无明显差异（均P＞0.05）。

表2 Bcl-2反义核酸对SK-N-SH细胞周期和凋亡的影响 （±s）

表2 Bcl-2反义核酸对SK-N-SH细胞周期和凋亡的影响 （±s）

注：与对照组相比，＊P＜0.01

组别 G0／G1 S G2／M 凋亡率（%）对照组41.9±1.3 45.6±1.9 13.8±1.3 0.32±0.12 Gibco组 42.0±3.4 41.4±2.6 16.3±2.3 3.53±0.35 SODN＋Gibco组 45.3±2.7 37.4±1.5 18.1±4.2 4.86±1.26 ASODN＋Gibco组 37.1±2.3＊38.3 ±2.6 24.8±0.4＊23.25 ±2.34 ＊

3 讨论

BcL-2（B-cell lymphoma／Leukemia-2）原癌基因是抑制细胞凋亡的重要基因。针对BcL-2的反义核酸技术能够抑制多种肿瘤细胞增殖，诱导细胞发生凋亡或增加肿瘤对传统药物的敏感性［2］。本研究设计了针对BcL-2的反义核酸ASODN，另又设计了正义核酸SODN作为与ASODN相对照的特异序列。细胞增殖与凋亡实验结果均显示正义序列对细胞的增殖与凋亡没有明显影响。

研究发现［3］细胞增殖周期调控异常与肿瘤发生关系密切，细胞增殖是通过细胞周期的运转来实现的，细胞周期破坏常会导致肿瘤的发生。本研究实验结果表明：转染BcL-2反义核酸后72h，细胞生长抑制率达到68.24%，明显高于正义组和脂质体组（P＜0.01）。与一些反义核酸对肿瘤细胞的增殖研究结果一致［4］。

本研究用FCM检测BcL-2反义核酸作用后细胞周期分布特点，结果发现G2／M期细胞数量明显升高。表明细胞周期阻滞于G2／M期，这可能是BcL-2反义核酸抑制SK-NSH细胞增殖的机制之一。抑制凋亡基因Bcl-2是促进凋亡发生的线粒体依赖途径的重要调控者［5］。本研究FCM检测细胞凋亡结果显示：Bcl-2反义核酸转染48h后细胞凋亡率大幅增加，达到23.25%。这与Lombet等［5］的研究结果是一致的。

以上研究证实：脂质体方法转染BcL-2反义核酸进入人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞，体外实验可抑制细胞生长，阻滞细胞周期于G2／M期，并可诱导细胞凋亡。因此BcL-2基因有望成为NB患儿肿瘤靶向治疗的靶基因。

［1］Ikeda H，Hirato J，Akami M，et al.Bcl-2oncoprotein expression and apoptosis in neuroblastoma［J］.J Pediatr Surg，1995，30（6）：805-808.

［2］Adams JM，Cory S.The Bcl-2protein family：Arbiters of cell survival［J］.Science，1998，281（5381）：1 322-1 326.

［3］Rodriguez-Nieto S，Zhivotovsky B.Role of alterations in the apoptotic machinery in sensitivity of cancer cells to treatment［J］.Curr Pharm Des，2006，12（34）：4 411-4 425.

［4］Mendona LS，Firmino F，Moreira JN，et al.Transferrin receptor-targeted liposomes encapsulating anti-BCR-ABL siRNA or asODN for chronic myeloid leukemia treatment［J］.Bioconjug Chem，2010，21（1）：157-168.

［5］谢松强，李骞，张亚宏，等.萘酰亚胺-多胺缀合物NNINspm通过PI＿3K／Akt信号通路诱导肝癌细胞凋亡［J］.中国药理学通报，2010，26（2）：169-174.

［6］Lombet A，Zujovic V，Kandouz M，et al.Resistance to induced apoptosis in the human neuroblastoma cell line SK-N-SH in relation to neuronal differentiation.Role of Bcl-2protein family［J］.Eur J Biochem，2001，268（5）：1 352-1 362.