核转录因子-κB拮抗剂PDTC抗大鼠肝纤维化作用研究*

陆翠华，肖明兵，潘 亮，朱 净，黄 华，袁伟燕，李晶菁

（南通大学附属医院消化内科，江苏226001）

肝纤维化是继发于慢性肝损伤后组织修复过程中的代偿反应，也是慢性肝病发展为肝硬化前的病理过程。核转录因子κB（Nuclear factor kappa B，NF-κB）可以通过调节多种基因的表达而参与疾病的发生。肿瘤坏死因子（TNF-α）作为炎症细胞因子,不仅可激活细胞因子级联反应,且可促进氧自由基、一氧化氮、细胞色素C等物质生成。前期研究结果显示，随着肝纤维化程度的加重NF-κB的表达逐渐增强，且与TNF-α及细胞外基质主要成分Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达密切相关，表明NF-κB参与了肝纤维化的发生和发展[1]。本研究通过在四氯化碳（CCl4）大鼠肝纤维化模型中应用NF-κB抑制剂吡咯烷二硫基甲酸盐（PDTC），观察其对肝纤维化的影响效果。

1 材料和方法

1.1 材料 雄性清洁级SD大鼠40只，体重150～250g由南通大学实验动物中心提供。PDTC（上海三爱思试剂有限公司），CCl4（江苏强盛功能化学有限公司）。兔抗大鼠NF-κB、TNF-α、Ⅰ、Ⅲ型胶原多克隆抗体（武汉博士德生物工程公司）。两步法RTPCR试剂盒（上海杰美生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立、分组和处理：随机分为4组：CCl4模型组10只，皮下注射60%CCl4（V/V）（精制橄榄油配置）3 mL/kg体重，每周2次，共6周。正常对照组10只，皮下注射等体积橄榄油，每周2次，共6周。PDTC治疗组10只，在开始注射CCl4造模的同时，腹腔注射NF-κB抑制剂PDTC(50 mg/kg·w，生理盐水配置)，每周1次，持续6周。阴性治疗对照组10只，在开始注射CCl4造模的同时，腹腔注射等体积生理盐水，每周1次，持续6周。分别在CCl4注射6周末处死大鼠，取肝组织待检。

1.2.2 免疫组织化学检测：Envision二步法检测NF-κB、TNF-α、Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白的表达，综合考虑染色强度和阳性细胞数。染色强度分数标准：0分(无着色)；1 分(淡黄色)；2 分(棕黄色)；3 分(棕褐色)。同样物镜倍数下计数阳性细胞数：1个视野内着色细胞 0 分(0%)；1 分(1%～25%)；2 分(26%～50%)；3 分(51%～75%)；4 分 (76%～100%)。检测结果评定标标准：两项得分相加 0～2 分为阴性表达“-”；3～4 分为“+”；5～6 分为“++”；7 分为“+++”。

1.2.3 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）：RT-PCR检测各组NF-κB、TNF-α及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达。从 GeneBank 查取基因序列，NF-κB、TNF-α 及Ⅰ、Ⅲ型胶原基因编号分别为XM_001075876.1，NM_012675.3，XM_001081230，NM_032085，以Primer5软件设计NF-κB、TNF-α及Ⅰ、Ⅲ型胶原的引物各一对，其序列分别为：NF-κB：5′-GCCCTCGTGGACAGCACCAC-3′，5′-GGTTTCCGGGGTGCGGAAGG-3′ ；TNF-α:5′-CATTCCTGCTCGTGGCGGGG-3′,5′-CGGGGCAGCCTTGTCCCTTG-3′；Ⅰ型胶原：5′-GGCAAGACAGTCATCGAATACA-3′，5′-GATTGGGATGGAGGGAGTTTA-3′；Ⅲ型胶原：5′-CCACCCTGAACTCAAGAGC-3′，5′-TGAACTGAAAGCCACCATT-3′；GAPDH：5′-AACGACCCCTTCATTGAC-3′，5′-TCCACGACATACTCAGCAC-3′，产物大小分别为 564、339、147、212 及 191 bp，由上海生工生物有限公司设计与合成。Trizol法提取肝组织RNA，逆转录合成cDNA，35个循环进行PCR扩增，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，鉴定扩增条带。将产物条带的电泳图谱用摄像仪扫入电脑，用“凝胶分析软件”对条带进行分析，读取积分吸光度值 (IA值)。以NF-κB、TNF-α及Ⅰ、Ⅲ型胶原IA/GAPDH平均IA值表示NF-κB、TNF-α及Ⅰ、Ⅲ型胶原的相对表达量。

1.3 统计学处理 所有数据由Stata7.0统计软件进行分析，免疫组织化学法结果中，各组间NF-κB、TNF-α与Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达强度比较采用秩和检验；NF-κB、TNF-α与Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA相对表达量组间比较采用方差分析，组间两两比较采用q检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 动物死亡情况 肝纤维化模型组死亡2只，生理盐水组死亡1只,其余组动物无死亡。

2.2 各组NF-κB、TNF-α与Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白免疫组织化学检测结果 NF-κB主要分布在肝细胞核内，TNF-α主要位于肝细胞的胞浆，Ⅰ、Ⅲ型胶原主要表达在汇管区和中央静脉周围。正常对照组NF-κB、TNF-α 与Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白微量表达（-或+）。模型组和阴性治疗对照组4种蛋白均为强阳性表达（+++）。4种蛋白在PDTC治疗组表达较模型组明显减弱（多为+，少数++）。PDTC治疗组与模型组之间比较，差异有统计学意义（NF-κB：P=0.011；TNF-α：P=0.021；Ⅰ型胶原：P=0.013；Ⅲ型胶原：P=0.016），见图1。

图1 NF-κB及TNF-α蛋白在各组大鼠肝组织中的表达

2.3 RT-PCR检测各组NF-κB、TNF-α与Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA结果 RT-PCR电泳检测见图2。半定量结果显示：正常对照组NF-κB、TNF-α与Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA相对表达量在4组中最低；肝纤维化模型组及生理盐水组NF-κB、TNF-α与Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达量均明显升高，两组比较，q值分别为0.024、0.018、0.015 和 0.017，P 值均＞0.05，差异无统计学意义。PDTC治疗组NF-κB、TNF-α与Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达量较之模型组明显下降，两组比较q 值分别为 3.588、3.612、3.602、3.591，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

图2 NF-κB、TNF-α与Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA在各组大鼠肝组织中的表达

3 讨 论

肝纤维化的本质是肝内细胞外基质的沉积增加和成分的改变，该过程与大量细胞因子的释放而激活肝星形细胞（HSC），使其转化为肌成纤维细胞密切相关。

NF-κB是能与多种基因启动子或增强子部位κB位点发生特异性结合，并促进其转录蛋白质。Gerondakis等[2]研究表明NF-κB表达与许多细胞因子及炎症介质的产生有关，从而参与多种疾病的发生。NF-κB尚能调控与肝纤维化发生和发展密切相关的转化因子β1等的表达[3-4]，促进肝纤维化进程。Friedman[5]研究显示NF-κB还是巨噬细胞潜在的调节因子，巨噬细胞在肝纤维化进程中促进肝星形细胞活化，在恢复期使活化的肝星形细胞凋亡。Donglai Cui等[6]用NF-κB特异性小干扰RNA转染大鼠肝星形细胞，发现NF-κB特异性小干扰RNA能抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的产生，减少I型胶原等的产生。所以阻断NF-κB的表达，能促进肝星形细胞凋亡，减少细胞外基质沉积，从而有助于肝纤维化的恢复。

PDTC为二硫氨基酸酯，是NF-κB抑制剂，通过其抗氧化作用可抑制TNF-α诱导的反应性氧自由基的产生和NF-κB活性[7]。它已被广泛应用于心肌疾病、糖尿病、肾病等治疗研究[8-9]。本研究分别通过免疫组化和RT-PCR法证实，PDTC治疗组肝组织中NF-κB和TNF-α mRNA和蛋白的表达均较肝纤维化模型组和生理盐水组明显下降，说明PDTC能有效抑制氧化应激所致的NF-κB活化，减少TNF-α等炎症介质分泌，从而缓解肝纤维化进程。另外，PDTC治疗组大鼠肝组织中I、III型胶原含量明显低于生理盐水组和模型组，表明PDTC可通过抑制NF-κB表达，从而减少细胞外基质的沉积，对肝纤维化有比较明显的改善作用。但PDTC治疗组肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量仍高于正常对照组，说明PDTC治疗在一定时间内未能使纤维化肝脏完全恢复正常。一方面可能是疗程或观察时间不足，另一方面是否有其他因素在肝纤维化发生和发展中起作用，这还有待于进一步地研究。

[1]朱净，范建荣，潘亮，等．NF-κB在鼠肝纤维化组织中的表达及其与a-SMA,III型胶原的相关性[J]．世界华人消化杂志，2012，20（22）：2081-2085．

[2]Gerondakis S,Grumont R,Gugasyan R,et al.Unravelling the complexities of the NF-kappaB signalling pathway using mouse knockout and transgenic models[J].Oncogene,2006,25(51):6781-6799.

[3]Li J,Hu W,Baldassare JJ,et al.The ethanol metabolite,linolenic acid ethyl ester,stimulates mitogen-activated protein kinase and cyclin signaling in hepatic stellate cells[J].Life Sci,2003,73(9):1083-1096.

[4]Yang H,Zhao LF,Zhao ZF,et al.Heme oxygenase-1 prevents liver fibrosis in rats by regulating the expression of PPARγ and NF-κB[J].World J Gastroenterol,2012,18(14):1680-1688.

[5]Friedman SL.Mac the knife?Macrophages-the doubleedged sword of hepatic fibrosis[J].J Clin Invest,2005,115(1):29-32.

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[8]黄莺，马依彤，杨毅宁，等．NF-κB抑制剂PDTC对小鼠急性心肌梗塞后Wnt信号通路的影响[J]．心血管康复医学杂志，2010，6（19）：230-234．

[9]朱铁年，刘建坤，刘桂红，等．吡咯烷二硫基甲酸酯对2型糖尿病大鼠心肌的保护作用 [J]．中国病理生理杂志，2011，27（6）：1149-1153．