消斑固斑片多环节抑制和稳定易损斑块的机制研究*

孙慧君

(河南中医学院第二附属医院，河南郑州450002)

研究表明:易损斑块破裂和崩解是多因素、多环节作用的结果。从炎性反应、脂质浸润、斑块内新生血管等方面诠释动脉粥样硬化斑块的易损性，对研究动脉粥样硬化发生发展机制的探讨有着重要作用，也为临床上诊断动脉粥样硬化易损斑块、治疗急性血管事件提供了思路和靶标［1］。消斑固斑片是课题组在易损斑块“微型痰瘀毒“理论基础上研制的有效方药。该方药能有效地抗炎、降脂、逆转或消退AS斑块和促进新生血管生成。本研究拟在前期研究基础上，重点探讨消斑固斑片对脂蛋白相关磷脂酶A2、血管内皮生长因子表达和斑块内新生血管数的干预作用，探讨其稳定易损斑块的机制及药效学基础。

1 材料与方法

1.1 动 物

新西兰纯种白兔46只，体质量1.5～2.5 kg，由郑州大学动物实验中心提供，动物合格证号:2005－0012。

1.2 药品、试剂与仪器

消斑固斑片由余甘子30 g、神曲15 g、山楂30 g等药物组成，由河南中医学院中药制剂室制备，每粒0.46 g，相当于含生药6.0 g。中国斑点蛙蛇毒由广州蛇毒研究所提供，批号gz－03;血管内皮生长因子(VEGF)，单克隆抗体试剂盒(批号AZ－001)，高超敏C－反应蛋白(hs-CRP)(批号17320501)和脂蛋白磷脂酶A2(LP-PLA2)酶联免疫试剂盒(批号CSBE06937Ca)，均由武汉博士德生物工程公司提供。LDZ5－2离心机，北京医用离心机厂产品;MS1型快速组织均匀浆机，无锡沃信仪器有限公司产品;MP200－A型电子天平，上海精密仪器厂产品;病例图像分析系统，江省捷达科技发展有限公司产品。

1.3 高脂饲料的制备

根据预实验并参考文献［2］加以改进，配方:猪油(占10%)、质量浓度1.5%胆固醇(占1.5%)、胆盐(占 0.2%)、蛋黄粉(占 5.0%)、甲基硫氧嘧啶(占 0.2%)、基础饲料(占83.1%)。

1.4 模型的建立、分组与给药

经兔耳缘静脉注射30 g/L戊巴比妥钠(30μg/g)麻醉，无菌条件下做颈正中切口;分离右颈总动脉，两端以动脉夹阻断血流;1 mL注射器针头刺入右颈总动脉，生理盐水冲洗置换出血管内的血液后抽空血管腔;无菌注射器抽取液氮快速注入右颈总动脉(液氮在血管内即刻气化为超低温氮气)，反复3次，历时约2 min，以造成血管内皮冻伤;放开动脉夹恢复血流，压迫止血;常规使用抗生素预防感染，术后高脂饲料喂养8周。于8周末，随机抽取2只兔，病理切片证明As破裂斑块形成。将造模成功兔随机分为模型对照组和消斑固斑组两组，每组10只。模型对照组用生理盐水灌胃，消斑固斑组用消斑固斑片药液1.2g/kg灌胃，两组均按 2.0μL/g体质量给药，2次/d，连续灌胃15 d。两组均予高脂饮食至服药结束。于处死动物前24，48 h参考Constantinides等［3］方法进行药物触发:中国斑点蛙蛇毒0.15μg/g腹膜下注射，30 min后，耳缘静脉注射组织胺0.02μg/g，以促使斑块发生实验性破裂。

1.5 检测指标

1.5.1 标本采集与处理

实验开始第8周末及第10周末，禁食12 h以上，清晨空腹耳中动脉采血，离心，留取上清液，取出血清备用。另以斑块破裂部位为中心，以3 mm厚度横断连续取材(包括病变部位上下端的正常动脉)，100 g/L福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色。

1.5.2 易损斑块形态学指标

光学显微镜下观察易损斑块形态学变化，包括:血管外弹力膜面积(externaielastic membrance area，EEMA)，管腔面积(lumen area，LA)，斑块面积(plaque area，PA)。

1.5.3 斑块内新生血管数的变化

采用IMS型彩色病理图像分析系统测量每1个切片斑块的总面积，然后根据测量的多个指标，来计算斑块的平均面积。动脉粥样硬化斑块区内小的棕色团，其中管腔直径＞10μm者即为新生血管。计算400倍视野中新生血管数，随机测定5个视野，取其均值作为该样本的测定值。

1.5.4 斑块内VFGF蛋白表达水平

采用免疫组化检测斑块内VFGF蛋白水平阳性表达。胞浆内出现棕黄颗粒沉着为VFGF阳性反应，用TIGER－920G细胞图像分析仪测定5个视野bFGF阳性染色的平均光密度值(AOD)，取其均值以代表斑块内VFGF蛋白表达的水平。

1.5.5 血清 LP-PLA2、hs-CRP

采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法方法测定血清中LP-PLA2、hs-CRP水平的变化，按 ELISA试剂盒说明书操作。

1.5.6 TC、TG、HDL-C、LDL-C

采用酶法检测TC、TG，磷钨酸－镁沉淀法检测HDL-C、LDL-C。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计分析软件处理。计量资料数据以均数()±标准差(s)表示，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 两组易损斑块形态学指标对比

与模型对照组对比，消斑固斑组颈动脉EEMA、LA和PA面积缩小，差别有统计学意义(P＜0.05)，说明消斑固斑片具有较好消斑固斑作用。见表1。

表1 两组易损斑块形态学指标对比 s

表1 两组易损斑块形态学指标对比 s

注:与模型对照组对比，*P ＜0.05。

组 别 动物数 PA/mm2 EEMA/mm2 LA/mm2 8 5.89 ±3.29 14.45 ±1.30 8.3 ±4.24消斑固斑组 8 2.55 ±1.04* 9.48 ±1.96* 6.93 ±2.12模型对照组*

2.2 两组易损斑块VFGF蛋白表达水平和新生血管数量对比

与模型对照组对比，消斑固斑组斑块内新生血管数量、VEGF蛋白阳性表达明显降低，差别有统计学意义(P＜0.05)，说明消斑固斑片通过降低VEGF在粥样斑块中的表达，抑制斑块内新生血管形成，达到稳定斑块的作用。见表2。

表2 两组易损斑块VFGF蛋白表达水平和新生血管数量对比 ± s

表2 两组易损斑块VFGF蛋白表达水平和新生血管数量对比 ± s

注:与模型对照组对比，*P ＜0.05。

组 别 动物数 VEGF表达/AOD 每个视野内新生血管数量/个0.32 ±0.09 183.5 ±1.8消斑固斑组 8 0.18 ±0.04* 97.9 ±0.45模型对照组8*

2.3 两组血清LP-PLA2、hs-CRP水平对比

模型对照组治疗前后血清LP-PLA2变化明显，差别有统计学意义(P＜0.05)，显示炎症反应在斑块演变过程逐渐加重，表明斑块破裂与血清LPPLA2具有相关性。消斑固斑组治疗前后血清LPPLA2、hs-CRP变化不明显，差别无统计学意义(P＜0.05);治疗后血清 LP-PLA2、hs-CRP 相比，治疗组LP-PLA2、hs-CRP降低明显，P ＜0.05，说明固斑消斑片可通过抑制血清LP-PLA2、hs-CRP减少动脉粥样硬化斑块形成，防止破裂斑块的作用。见表3。

表3 两组血清LP-PLA2、hs-CRP水平对比

2.4 两组 TC、TG、HDL-c、LDL-c对比

模型对照组血脂前后相比变化明显(P＜0.05)，消斑固斑组血脂治疗前后相比变化不明显(P＞0.05);两组治疗后相比，治疗组血脂降低明显，差别有统计学意义(P＜0.05)，说明消斑固斑片降血脂效果明显。见表4。

表4 两组 TC、TG、HDL-c、LDL-c 对比 mmol·L－1，± s

表4 两组 TC、TG、HDL-c、LDL-c 对比 mmol·L－1，± s

注:与模型对照组治疗后对比，*P＜0.05;与本组治疗前对比，#P＜0.05。

TC TG HDL-C LDL-C模型对照组 8 治疗前组 别 动物数 时间4.8 ±0.79 3.08 ±0.47 2.01 ±0.5 3.49 ±0.75治疗后 10.12 ±1.91# 7.08 ±0.53# 1.98 ±0.83# 5.88 ±0.23#消斑固斑组 8 治疗前 4.89±0.47 3.12±0.32 2.02±0.23 3.75±0.41治疗后 5.12 ±1.81* 4.69 ±0.12* 2.84 ±0.41* 3.90 ±0.57*

3 讨论

易损斑块是指那些不稳定和有血栓形成倾向的斑块，主要包括破裂斑块、侵蚀性斑块和部分钙化结节性病变。2003年Naghvi等［4］给出了易损斑块的组织学定义和标准，主要的标准包括活动性炎症、薄的纤维帽和大的脂质核心。研究表明:斑块内新生的微血管与炎症、纤维帽厚度、脂核大小一样，被认为是目前斑块破裂的最有利的独立预测因子。炎性反应及炎性介质对不稳定斑块的破裂起着至关重要的作用，也作为外因影响着板块的稳定性。在晚期斑块中，随着纤维帽的形成，固有管腔来源的炎性细胞减少，但斑块内形成的新生血管具有更强的介导炎性细胞趋化并进入斑块的能力。因此，新生血管和炎性细胞之间可能存在着正反馈环路:一方面新生血管表达粘附分子并趋化聚集炎细胞进入斑块，另一方面斑块局部的炎细胞又产生生长因子并促进血管新生。二者互相促进，导致了斑块的不稳定。目前中医药治疗易损斑块的临床研究主要集中在消除、稳定易损斑块和通过抑制易损斑块的崩解而降低急性心脑血管疾病的发生［5－6］;在实验研究方面，以探讨中医药对AS抑制平滑肌细胞增殖、保护血管内皮细胞、调节血脂代谢、抗脂质过氧化等作用机制［7－8］为主。课题组基于痰瘀是斑块形成病理基础，毒邪是斑块溃烂、崩解的导火索，因痰致瘀、痰瘀互结、变从毒起是易损斑块病理演变的认识，采用化瘀降浊排毒法的代表方——消斑固斑片治疗易损斑块。消斑固斑片由余甘子、荷叶、山楂、泽泻、大黄等组成。方中余甘子归肝脾胃经，擅长涤化浊脂、消痰理气，以除血中无形之脂，使浊降毒清，为君药。荷叶有理气散滞之功，通血活气，使浊化瘀消，为臣药。山楂味酸而甘，善消肉食油腻之积;泽泻利水渗湿，使浊脂湿毒之邪从小便而走;大黄涤荡肠胃，推陈出新，使浊瘀毒热之邪从阳明而行。此3药共佐君臣消斑固斑之功［9－12］。

本研究发现:消斑固斑片可明显使总胆固醇、LDL-C降低，差别有统计学意义(P＜0.05)，此外，颈动脉的 EEMA、LA、PA较模型对照组变小(P＜0.05)，说明消斑固斑片具有较好的消斑固斑作用。VEGF是有促进血管内皮细胞有丝分裂的生长因子，在血管新生过程中具有重要意义，抑制VEGF在动脉粥样斑块中的表达可在一定程度上控制斑块生长进程。消斑固斑组与模型对照组对比，斑块内新生血管数量、VEGF蛋白阳性表达明显降低(P＜0.05)，说明消斑固斑片通过抑制VEGF在粥样斑块中的表达，减少斑块内血管新生，达到稳定斑块的作用。血清LP-PLA2、hs-CRP活性能反映冠状动脉粥样硬化病变的严重程度。消斑固斑片可使血清LPPLA2、hs-CRP降低明显，显示消斑固斑片通过抑制血清LP-PLA2、hs-CRP来减少动脉粥样硬化斑块形成，防止破裂斑块作用。综上所述，消斑固斑片通过影响脂质代谢、炎症反应和斑块内血管新生，从多环节、多角度有效地逆转或消除斑块、防止斑块破裂。此为临床治疗易损斑块、降低急性血管事件发生，提供了思路和靶标。

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