苦马豆中总生物碱的提取工艺研究*

张 立，李能莲，舍雅莉，王雅莉，陈 丽，骆亚莉，胡树名，杨扶德

(甘肃中医学院国家中医药管理局中药生药三级科研实验室，甘肃兰州730000)

苦马豆为豆科苦马豆属植物苦马豆Swainsonia salsula Taubert.的带根全草，具有补肾、固精、利水等功效，为甘肃、宁夏、青海等地民间常用药，常被用来治疗阳痿、遗精、白带及小便不利等，民间药物名为“马皮泡”“尿泡草”“铃当草”“羊卵泡”“红苦豆子”。民间常用苦马豆素(Swainsonine，SW)治疗肾炎水肿、慢性肝炎、肝硬化腹水等，具有悠久的应用历史［1］。苦马豆素具有很强的抗肿瘤、抗辐射及免疫增强活性，作为一种崭新的抗肿瘤药物，已引起了极大关注，是当前研究的热点［2］。苦马豆素是从苦马豆中提取的吲哚兹定生物碱，分子结构是吲哚兹定环的1，2，8 位上各有 1 个羟基，化学名为 1，2，8-三羟基八氢吲哚兹定，属于醇类，又被命名为吲哚兹定三醇。苦马豆素的提取是采用对样本酸化、碱化后从小极性溶剂到大极性溶剂分别萃取，再经离子交换柱或硅胶柱层析从中分离苦马豆素［3］。这种方法提取周期长、步骤繁琐，有待于进一步改进。此外，也有人工合成苦马豆素的报道［4］，但方法步骤过多、产率低、不适于批量生产。本研究在前人研究的基础上，采用3种不同工艺提取苦马豆中总生物碱，并比较总生物碱得率，探索一种经济简便、可用于苦马豆素批量生产的提取分离工艺，为苦马豆素的开发利用提供基础。

1 药品与试剂

苦马豆 Swainsonia salsula Taubert.地上部分，2011年8月采集于甘肃省古浪县张家湾，由甘肃中医学院杨扶德教授提供并鉴定。自然干燥，粉碎，阴凉处保存备用。750，850，950 g/L乙醇及碘化铋钾试剂，均由利安隆博华(天津)医药化学有限公司提供;化学试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 乙醇回流提取及总苦马豆碱含量测定

此为第1种工艺。准确称取苦马豆干草粉3份，各5 g;分别经750，850，950 g/L乙醇回流提取3次，每次2 h;水浴挥去乙醇至浸膏;2 mol/L HCl溶解后过滤得酸水液;3 000 r/min离心15 min得上清液;弃去固体杂质;用氨水调水相pH值至9～10;正丁醇萃取6～8次挥去正丁醇得总生物碱，称质量，测提取物含量。碘化铋钾试管反应为阴性停止萃取。实验重复5次。

2.2 超声提取及总苦马豆碱含量测定

此为第2种工艺。准确称取苦马豆干草粉4份，各5 g;分别用75 mL自来水浸泡苦马豆草粉12 h;置于59 kHz超声清洗器45℃，分别处理30，60，90，120 min，重复2 次，过滤得水液;水液置水浴锅上80℃浓缩到30 mL后，用2 mol/L HCL酸化;3 000 r/min离心15 min得上清液;弃去固体杂质;用氨水调水相pH值至9～10;正丁醇萃取6～8次后回收溶剂得总生物碱称质量，测提取物含量。碘化铋钾试管反应为阴性停止萃取。实验重复5次。

2.3 水提取及总苦马豆碱含量测定

此为第3种工艺。准确称取苦马豆干草粉5 g;加75 mL自来水浸泡过夜;常压下煮沸，每次1 h，共3次，过滤得水液;煮沸浓缩到15 mL;用2 mol/L HCl酸化过滤得酸水液;3 000 r/min离心15 min得上清液;弃去固体杂质;最后用氨水调水相pH值至9～10;正丁醇萃取6～8次后回收溶剂得总生物碱称质量，测提取物含量。碘化铋钾试管反应为阴性停止萃取。实验重复5次。

3 结果

见表1～3。

表1 不同提取方法生物碱出膏率对比

表2 不同处理间方差分析

表3 不同处理间差异显著性

通过表1～3结果分析:提取工艺1，2，3的总生物碱平均得率分别是6.641 9%、3.998 6%、1.311 6%。750 g/L乙醇回流提取总生物碱平均得率最高，与其他处理方法比较总生物碱平均得率差异显著及极显著(P＜0.01);850 g/L乙醇与超声60 min、水煮处理间具有显著差异(P＜0.05)。850 g/L乙醇提取的出膏率平行5次试验，差别较大，分析原因可能是工艺的可重复性较差，同时850 g/L乙醇提取的成分较为黏稠，对生物碱纯化不利。

4 讨论

苦马豆Swainsonia salsula Taubert.为豆科苦马豆属植物，在我国其资源丰富，对其提取物苦马豆素药用价值的发掘和研究方兴未艾。Colegate等［5］首次分离苦马豆素是用热乙酸乙酯索氏提取24 h，水溶部分上强酸性阳离子交换柱，收集稀氨水洗脱部分，浓缩后的残留物过药用琼脂糖凝胶柱，回收溶剂后重结晶，最后得到白色针状结晶。葛鹏斌等［6］分别从茎直黄芪和小花棘豆中分离出苦马豆素。童德文等［7］通过升华法和高效液相色谱从甘肃棘豆中分离得到苦马豆素纯品，得率为14.52μg/g。李勤凡等［8］采用萃取法改进了甘肃棘豆中苦马豆素提取工艺，但得率仅为5μg/g。上述方法提取周期长、步骤繁琐，实验成本高。

本次研究在条件相同的情况下，比较了乙醇回流、超声处理法和水煮法3种提取工艺对苦马豆中总生物碱得率的影响。水煮法在3种工艺中消耗成本最低，但苦马豆素总碱得率最低，且它要求物质的亲水性和热稳定性高，在萃取的过程中乳化现象严重，需要正丁醇萃取液长时间加热或静置离心以消除乳化现象，不适于批量生产。用超声提取中，将植物样品经水浸泡后采用超声技术处理(30，60，90，120 min)［9-13］，但总碱得率较低，也不适于苦马豆素总碱的批量生产。3种提取工艺中，乙醇回流提取中总碱平均得率高于其他两种工艺，其中750 g/L%乙醇得率最高，周期短、易于操作，试验中的溶剂回收后可以重复利用，是目前提取苦马豆素的一种最为简便经济的工艺。游离的生物碱及生物碱盐都能溶于甲醇和乙醇，虽然甲醇的沸点低于乙醇且极性比乙醇大，对生物碱盐类的溶解性强于乙醇，但甲醇对人体的毒害较大、价格高于乙醇，故本实验使用乙醇作为溶剂。乙醇质量浓度设计在750～950 g/L，是因为苦马豆中生物碱种类较多，仅使用水或乙醇做溶剂不能完全提取，且苦马豆为草本植物，材料的吸湿性比较强，所以选择的物料比较大，在第一次浸提时加量较多。此与陈绍淑［13］、赵宝玉［14］的报道一致。在提取过程中发现:950 g/L乙醇提取的成分中所含色素多，测定生物碱之前需用石油醚除掉色素;850 g/L乙醇提取的成分较为黏稠，对生物碱纯化不利;750 g/L乙醇提取的成分数量较少，颜色淡。由此可见，如果需要色素可使用950 g/L乙醇做提取溶剂;如果节约成本，可使用750 g/L乙醇做提取溶剂。同时苦马豆素为大极性生物碱，根据相似相溶的原理，本研究在提取过程中对植物样品经酸化、碱化处理后，直接使用了大极性的正丁醇对碱水液中生物碱进行萃取，省去了常规先使用氯仿、乙酸乙酯等小中极性溶剂反复萃取的步骤。

［1］甘肃省卫生局.甘肃中草药手册［M］.兰州:甘肃人民出版社，1973:1512.

［2］杨扶德，罗文蓉，林丽，等.苦马豆的生药学研究［J］.中医药学刊，2003，21(9):1587-1588.

［3］吴旭锦，杨鸣琦，白春黎，等.苦马豆素的来源及分离方法进展［J］.动物医学进展，2005，26(5):41-44.

［4］Gerres Heimgärtner，Dirk Raatz，Oliver Reiser.Stereoselective Synthesis of Swainsonines from Pyridines［J］.Tetrahedron，2005，61:643-655.

［5］Colegate SM，Dorling PR，Huxtable CR.A pectroscopicinvestigation of swainsonine:an a-mannosidase inhibitor isolated from Swainsonia canecens［J］.Aust JChem，1979，32:2257-2264.

［6］葛鹏斌，赵宝玉，童德文，等.小花棘豆中苦马豆素的提取分离与结构鉴定［J］.中国农学通报，2003，19(1):1-3.

［7］童德文，曹光荣，李绍君.甘肃棘豆中苦马豆素的分离与鉴定［J］.西北农林科技大学学报，2001，29(3):5-8.

［8］李勤凡，王建华，刘志斌，等.萃取法提取甘肃棘豆中的苦马豆素研究初报［J］.中国农学通报，2005，21(5):143-145.

［9］赵俊，童德文，税媛媛，等.甘肃棘豆草中苦马豆素的提取分离工艺比较研究［J］.西北植物学报，2006，26(7):1459-1463.

［10］王铮敏.超声波在植物有效成分提取中的应用［J］.三明高等专科学校学报，2002，19(4):45-53.

［11］郭孝武，吉晓芹.杜仲叶中总黄酮物质超声提取的研究［J］.西北植物学报，2003，23(11):1984-1987.

［12］申金龙，孙良顺，李峰，等.钩藤中总生物碱提取工艺研究［J］.安徽农业科学，2010，38(1):358-375.

［13］陈绍淑.小花棘豆生物碱系统分析及其活性研究［D］.杨凌:西北农林科技大学，2003.

［14］赵宝玉.疯草中生物碱系统分析及其毒性的比较病理学研究［D］.杨凌:西北农林科技大学，2001.