枳壳醇提物与葡萄内酯对血管性痴呆模型大鼠保护作用的实验研究*

★ 李锦文 陈来 罗小泉＊＊ (. 江西省贵溪市人民医院 贵溪335400;. 江西中医学院 南昌

330009)

血管性痴呆(Vascular dementia，VD)系指在缺血性、出血性及急慢性缺血缺氧性脑血管疾病引起的脑组织损害基础上产生的以高级神经认知功能障碍为主的一组临床综合征［1］。是我国最常见的老年痴呆类型之一。由于VD 严重危害患者的健康，同时给家庭和社会带来巨大经济压力和负担，因此，关于VD 的发病机理与治疗药物的研究日益受到世界各国政府和学者的高度重视［2－3］。枳壳醇提脂溶性成分(含川陈皮素、橘皮内酯、橘红素和葡萄内酯)。

大量文献报道橘红素，川陈皮素等具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、预防心血管疾病和神经保护作用［4－9］，可以抑制肿瘤坏死因子TNF－α 表达;同时文献也报道葡萄内酯是一种AchE 抑制剂［10－11］并对神经细胞具有保护作用［7－11］;但对枳壳醇提脂溶性成分与葡萄内酯对血管性痴呆模型鼠的实验研究还未见报道。本研究观察枳壳醇提脂溶性成分与葡萄内酯对结扎双侧颈总动脉大鼠学习记忆改善的影响及对生化指标的改变，探讨枳壳醇提脂溶性成分与葡萄内酯对血管性痴呆保护作用的作用机制。

1 材料

1.1 动物

SPF 级雄性SD 大鼠130 只，体重200 ±20g(湖南斯莱克实验动物有限公司，许可证号:SCXK(湘)2011 －0003，合格证号43004700000965)。

1.2 药品与试剂

枳壳醇提物脂溶性部位(含川陈皮素、橘皮内酯、橘红素和葡萄内酯);安理申(批号:071121A)卫村(中国)药业有限公司制造;MDA、SOD、AchE 测定试剂盒(批号均为:20100507)购于江苏省南京建成生物工程研究所。

1.3 仪器

UV － 1600 型分光光度计(北京瑞利公司);Morris 水迷宫硬件与视频分析系统(北京天鸣宏远科技发展有限公司);高速离心机(美国Sigma 公司)。

2 方法

2.1 VD 动物模型制备

采用双侧颈总动脉永久性结扎模拟血管性痴呆。大鼠术前禁食12 小时、禁水4 小时。用10%水合氯醛(0.35mL/100g)腹腔注射麻醉，仰卧位固定，颈前部备皮、消毒后，沿颈正中切开皮肤、肌肉，分离出双侧颈总动脉，套以“0”号丝线，分别结扎双侧颈总动脉的远近端，确保阻断动脉血流。术中大鼠体温保持在(36.5 ±0.5)℃，以防止低温对脑缺血保护作用。术后用青霉素钠水溶液局部涂敷，预防感染。假手术组仅进行颈前切开、分离，不结扎颈总动脉，其它同模型组操作。

2.2 动物分组及给药

选择96 只建模成功(双侧颈总动脉结扎造模后无肢体残疾的存活的大鼠)随机分成8 组(模型组、阳性药组、醇提物高中低组、葡萄内酯高中低组)，每组12 只，另假手术组12 只。分别灌胃安理申混悬液0.5mL/100g(相当于成人每日量的5mg/人·天)，1 次/天;枳壳醇提脂溶性浸膏3 组各0.5mL/100g(小、中、高剂量组分别为1g 浸膏/天、3g浸膏/天、6g 浸膏/天;葡萄内酯3 组各0.5mL/100g(小、中、高剂量组分别为10mg/天、20mg/天、60mg/天;模型组与假手术组分别灌胃等体积的生理盐水。共35 天。

2.3 动物行为学测试

采用Morris 水迷宫实验方法测试大鼠的学习记忆能力。Morris 水迷宫的装置由一不锈钢圆形水池通过摄像机与电脑连接所组成。圆形不锈钢直径160cm、高50cm 的圆形水池，水池内壁被漆为黑色，池内水深25cm，水温保持在(22 ±2)℃，房间内光照恒定，无光线直射在水池内。池壁上以四个等距离点将水池分为四个象限，在目标象限(设为第三象限)内距离池壁35cm 处放有一个直径为12cm、高23cm 的圆形黑色站台，站台位于水面下2cm。池壁内侧贴有不同形状的标记物。迷宫上方安置连接显示系统的摄像机，同步记录大鼠运动轨迹。采用北京天鸣宏远科技发展有限公司研制开发的Morris 水迷宫视频分析系统进行信息处理。进行定位航行实验和空间探索实验，共历时6 天。

2.3.1 定位航行实验

每天2 次，历时5 天，跟踪记录大鼠游泳轨迹。将大鼠面向池壁，分别从4 个入水点下水，记录在2分钟内寻找到平台的时间(称逃避潜伏期)，如果在2 分钟以上未找到平台，潜伏期记为120 秒。训练时实验者可以帮助大鼠找到平台，并停留10 秒。试验完后将大鼠放回鼠笼中。在第5 天，选取离平台最远象限作为入水点，此时大鼠的逃避潜伏期作为评价大鼠学习记忆能力的指标。

2.3.2 空间探索试验

定位航行试验完成后(第6 天)撤去平台，选择离原平台最远的象限为大鼠入水点，记录大鼠的游泳轨迹和时间，并测定在2 分钟内第1 次跨越原平台象限游泳的时间及频率［次数/(2 分)］作为评价大鼠学习记忆能力的指标。

2.4 组织形态学实验

Morris 水迷宫实验结束后，每组随机选取2 只大鼠，10%水合氯醛(0.35mL/100g)腹腔注射麻醉。用0.9%的生理盐水和4%多聚甲醛的磷酸缓冲液，灌注固定，逐级酒精脱水、透明、浸蜡、包埋，进行常规石蜡包埋切片，厚5μm，苏木精和伊红染色，低倍镜(10 ×10)确定海马区位置，高倍镜(10 ×40)观察海马CA1 区锥体层细胞的形态，在光镜下拍照(见图1)。

2.5 AchE、SOD 活性和MDA 含量测定

Morris 水迷宫实验结束后，将各组大鼠处死，取脑称重后加9 倍重量冰生理盐水制备10%匀浆，离心10 －15 分钟取上清。严格按试剂盒说明进行AchE、SOD 活性和MDA 含量测定。

2.6 统计学方法

所有的数据以(¯x±s)表示，采用SPSS11.5 进行方差分析和多组间均数比较，P ＜0.05 为差异有显著意义，P ＜0.01 为差异有极显著意义。

3 结果

3.1 枳壳醇提物脂溶性部位与葡萄内酯增强VD大鼠学习记忆能力

3.1.1 定位航行实验

如表1 所示，葡萄内酯小、中、高剂量组和浸膏高剂量组大鼠逃避潜伏期则较模型组明显缩短，具有显著性差异(P ＜0.05)。阳性药对照组和浸膏小、中剂量组大鼠逃避潜伏期则较模型组明显缩短的趋势，可能给药剂量小。

表1 定位航行逃避潜伏期(¯x±s，n=12)

1.2 空间探索实验

如表2 所示，葡萄内酯小、中、高剂量组跨越原平台次数与模型组比较具有显著性差异(P ＜0.05)。阳性药对照组和浸膏小、中、高剂量组跨越原平台次数与模型组比较具有明显改善。大鼠逃避潜伏期则较模型组有明显缩短的趋势。

表2 空间探索结果(¯x±s，n=12)

3.2 枳壳醇提脂溶性部位与葡萄内酯改善VD 大鼠海马CA1 区病理改变

如图b 所示，HE 染色观察到模型组大鼠海马CA1 区表现出明显的缺血性病理改变，核固缩和细胞呈无秩序排列。如图a、c 和d 所示，假手术组、给药组(浸膏高剂量组和葡萄内酯组)和阳性药组大鼠海马CA1 区组织结构完整，神经元排列整齐、规则。

图1 典型海马锥体细胞照片(HE×400)

3.3 枳壳醇提脂溶性部位与葡萄内酯对VD 大鼠脑组织AchE、SOD 活性和MDA 含量的影响

表3 表明，假手术组、葡萄内酯低、中、高剂量组和枳壳醇提脂溶性部位低、中、高剂量组与模型组相比，大脑组织中AchE 活性明显高于模型组，有显著性差异(P ＜0.05)。而假手术组、葡萄内酯低、中、高剂量组和枳壳醇提脂溶性部位低、中剂量组的脑组织中SOD 活性低于模型组，这可能与造模时大鼠处在低温有关，需进一步验证。假手术组、葡萄内酯低、中、高剂量组和枳壳醇提脂溶性部位低、中剂量组的脑组织中MDA 含量明显低于模型组MDA 含量，有显著性差异(P ＜0.05)。

表3 各组大鼠AchE、SOD 活力和MDA 含量变化(¯x±s，n=12)

4 讨论

采用永久性结扎双侧颈总动脉建立的血管性痴呆模型的模型组大鼠逃避潜伏期明显延长，穿越平台的次数明显减少，表现出一定的痴呆症状。与假手术组无论是学习记忆能力(定位航行和空间探索)还是生化指标的检测(AchE、SOD 活力和MDA含量变化)均存在显著性差异。

中枢胆碱系统功能下降导致认知能力受损，表现为胆碱能神经功能下降。乙酰胆碱(Ach)降解加快。由于乙酰胆碱性质极不稳定，容易出现水解极难准确测定其含量。而乙酰胆碱酯酶(AchE)是Ach 的降解酶，测定脑组织中AchE 的活性可以判断Ach 含量的变化［12］因而被认为是胆碱能神经元的重要标志酶。葡萄内酯各剂量组及醇提物高剂量组均能降低AchE 的活性，从而促进中枢神经系统中Ach 的递质水平。这种提高Ach 的方法已经成为治疗VD 和AD 等慢性神经组织退化病变最有希望的途径之一。

SOD 是机体内自由基的清除剂，可以减少自由基对脑组织的损伤作用。本实验结果显示，与模型组比较，葡萄内酯低、中、高剂量组和枳壳醇提脂溶性部位低、中剂量组的脑组织中SOD 活性反而降低;与假手术组比较，模型组的SOD 活力升高，其原因可能为造模后大鼠由于缺血缺氧，对急剧增长的活性氧的一种过激反应。

从病理改变来看，枳壳醇提脂溶性部位高剂量组与葡萄内酯各组均能显著改善，定位航行枳壳醇提脂溶性部位高剂量组与葡萄内酯各组与模型组比较也有显著差异，而醇提脂溶性部位的中、低剂量只有好转趋势却没有统计学意义。由此推测葡萄内酯是主要的药效物质。葡萄内酯分子量小(298.38)、脂溶性强、易透过血脑屏障，通过对AchE 的抑制达到增加Ach 在脑中的含量，从而促进中枢神经系统中Ach 的递质水平，从而对血管性痴呆起到改善作用。其作用机制还有待进一步研究。

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