紫外线与氯化锂诱变选育高产乳糖酶米曲霉

刘芳宁，梁 琪，乔海军，杨 敏，张 炎，文鹏程，张卫兵，*

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070;2.甘肃农业大学理学院，甘肃兰州730070)

β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)又称β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，它能够催化β-D-半乳糖苷化合物中的β-D-半乳糖苷键发生水解，还具有转半乳糖苷活性。产乳糖酶微生物种类多样，包括多种细菌、酵母和霉菌［1］。不同微生物来源的乳糖酶酶学性质差异很大。酵母所产乳糖酶最适pH接近中性，被广泛应用于牛乳和乳清中乳糖的水解，但由于是胞内酶，不易提取;细菌乳糖酶最适pH接近中性，具有易于发酵、酶的稳定性等优势，但由于安全性问题，在食品工业中的应用受到了限制;霉菌来源的乳糖酶是胞外酶，提取方便，在p H为2.5～5.4和温度为50℃左右时，相对活力最高，主要用来处理生产干酪后的酸性乳清［1-3］。目前，乳糖酶在乳品、医药、分析、环境保护等方面都具有广阔的应用前景，然而较低的产量限制了乳糖酶的工业化生产及应用。通过遗传改良选育高产菌株，是实现乳糖酶高效生产的关键。紫外线和氯化锂是一种操作简便、效果较好的诱变方法，已经成功应用于多种产酶霉菌的菌种选育［4-5］。本研究以米曲霉(ATCC20423)为出发菌株，采用紫外辐照和紫外复合氯化锂对其进行诱变选育，以期选育出高产乳糖酶的突变株，为乳糖酶的工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米曲霉菌株(Aspergillus Oryzae) 编号ATCC20423;无水氯化锂 天津市凯信化学工业有限公司，分析纯;邻硝基苯 β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG) 北京经科宏达生物技术有限公司，分析纯;乳糖 上海中秦化学试剂有限公司，分析纯;麸皮 兰州市安宁区桃海市场，市售。

PDA培养基:马铃薯 200g，葡萄糖 20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然;诱变培养基:马铃薯200g，葡萄糖 20g，氯化锂 5～22.5g，琼脂 20g，蒸馏水1000mL，p H自然;初筛培养基:乳糖 1g，(NH4)2SO41g，KH2PO41.5g，琼脂 2g，称取 2g 麸皮，加入 100mL蒸馏水，煮沸10min，用四层纱布过滤，滤液补水至100mL，pH调至4.8，121℃下灭菌20min后冷却到60℃，加入微滤除菌的0.1%的ONPG溶液。摇匀后用灭菌的滴管在超净台上将其加入灭菌的1.0mL的离心管中，置于冰箱冷藏备用;固态发酵培养基:乳糖 10g，(NH4)2SO410g，KH2PO415g，蒸馏水 1000mL配置成溶液，调整p H4.8，然后将麸皮粉与上述溶液按1∶1.1(w/v)的比例混合，121℃下灭菌 20min;pH4.5的醋酸缓冲液:把50mL的2mol/L冰醋酸与11.3mL的4mol/L的氢氧化钠溶液混合，定容至1000mL，并用2mol/L的冰醋酸、4mol/L的氢氧化钠调整溶液p H到4.5±0.5。

HH-SZ65型数显恒温水浴锅 北京医疗设备厂;YZ-280型手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅 上海三申医疗器械有限公司;UV-5100型紫外-可见分光光度计 上海分析仪器有限公司;HZQ-X100型振荡培养箱 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;SW-CJ-ZFD型双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司;PHS-3C型数显酸度计 上海精密科学仪器有限公司;DHP-9162型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司;TGL-20M型高速冷冻离心机长江湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 出发菌株的活化 将米曲霉菌株接种于PDA斜面进行活化，30℃培养4～5d，待长满黄绿色孢子后备用。

1.2.2 单孢子悬液的制备 取培养好的斜面，用无菌生理盐水洗脱孢子后转移至装有玻璃珠的无菌锥形瓶中，充分摇动使孢子散开，用带脱脂棉的无菌漏斗过滤除去菌丝得到孢子悬液，将孢子浓度调整到106个/mL。

1.2.3 紫外诱变处理 取5mL孢子悬液置于无菌的直径6cm的平皿中，在磁力搅拌作用下距30W紫外灯 30cm 处分别照射 7、9、11、13、15、17、19、21min，对每个处理进行梯度稀释，取0.1mL涂布于平板培养基上，立即用黑布将平板包好，30℃避光恒温培养4d［6］，计数并测定菌株酶活，计算致死率和正突变率。

1.2.4 紫外与氯化锂复合诱变 将紫外诱变后的孢子悬液涂布于含0.5%、0.75%、1.00%、1.25%、1.5%、1.75%、2.00%、2.25%的氯化锂的诱变培养基平板上，30℃避光培养4d［7-8］，计数并测定菌株酶活，计算致死率和正突变率。

致死率(%)=(未处理平板菌落数-处理平板菌落数)/未处理平板菌落数×100

正突变率(%)=乳糖酶活力提高的菌落数/诱变后长出的菌落总数×100

1.2.5 突变株的初筛 将诱变后长出的不同形态特征的菌落接种到初筛培养基中，30℃培养3d。向初筛小管中喷洒10%Na2CO3溶液，静置数分钟，挑取颜色较黄小管的菌株，依次转接保存斜面，30℃培养至孢子成熟，于冰箱4℃保藏［9］。

1.2.6 突变株的复筛 将初筛得到的菌株活化后，接种至固态发酵培养基，30℃培养6d，在室温下加入5倍体积pH4.5的醋酸缓冲液180r/min振荡1h，然后用三层纱布过滤，收集滤液，在4℃、10000r/min条件下离心15min，取上清液测定乳糖酶活力，筛选出高产菌株［10］。

1.2.7 突变株遗传稳定性的测定 选取诱变后得到的乳糖酶产量较高的突变株连续传代8次，进行固态发酵培养后测定乳糖酶活力，判断其遗传稳定性。

1.2.8 出发菌株和突变株的产酶曲线 以出发菌株和突变株为待测菌株，挑取培养4d的斜面孢子3环接种于固态发酵培养基中，30℃恒温培养，每隔0.5d测定其酶活力，并绘制产酶曲线。

1.2.9 出发菌株和突变株的形态特征比较 将出发菌株ATCC20423和突变株点植于培养基进行培养，30℃培养后，观察菌落形态、菌丝体颜色等。

1.2.10 乳糖酶活力的测定 将在45℃下水浴10min的粗酶液0.5mL，加入已预热至45℃的1.5mL的含50mmol/L ONPG醋酸缓冲液(p H4.5)，在45℃下水浴10min，然后立即加入3.0mL 0.5mol/L的 Na2CO3终止反应［11］。于420nm处测定OD值，测定3次取平均值。以醋酸缓冲液作为空白。一个酶活力单位(U)定义为在上述条件下，每分钟水解ONPG生成1μmol ONP所需的酶量。

用已知浓度的ONP溶液做标准曲线，根据ONP的浓度C对应的OD值，利用最小二乘法建立回归方程:OD=4.5907C+0.021，相关系数R=0.9992。

酶活力计算公式:

式中，X为乳糖酶活力(U/mL);C为标准曲线中对应的ONP的浓度(μmol/mL);N为粗酶液稀释倍数;10为反应时间(min);5为反应体系的总体积(mL);0.5为反应体系加入粗酶液的体积(mL)。

2 结果与分析

2.1 紫外线诱变剂量的确定

出发菌株经紫外线照射不同时间的致死率和正突变率如图1所示。由图1可以看出，随着照射时间的延长，致死率逐渐增加。当处理时间为13min时，致死率为73.49%，当处理时间为21min时，致死率为94.9%。虽然总体菌株的减少减轻了筛选的负担，但得到的总数如果太少，选择的余地就会太小。而且正突变株也并不是随着致死率的增加，成严格的线性关系。采用紫外线进行诱变时，致死率达到70%～80%时，产生正突变的几率较高，有利于进一步筛选［12］，所以对致死率在60%～90%的诱变剂量的正突变率进行测定。当紫外线处理时间为15min时，致死率为81.90%，正突变率为5.41%，达到最大值。因此，本实验采用紫外诱变时间为15min的诱变剂量进行诱变处理。

2.2 紫外线复合氯化锂诱变剂量的确定

氯化锂单独起诱变作用不明显，但与紫外线复合诱变时可以明显提高诱变效果，这表明氯化锂起着促诱变作用［4］。出发菌株经紫外线照射15m in复合氯化锂诱变的致死率和正突变率如图2所示，致死率在LiCl质量浓度为1.25%范围内递增，超过该浓度后则上升趋势缓慢，当LiCl质量浓度为2.25%时，致死率为97.68%。正突变率在LiCl质量浓度较低的条件下不断增大，当LiCl质量浓度为1.5%时最大，为6.03%，此时致死率为83.68%，因此选择1.5%的LiCl溶液作为紫外复合氯化锂的促诱变剂。

表1 紫外照射诱变筛选结果Table 1 The screening result of UV treatment

表2 紫外照射复合氯化锂诱变筛选结果Table 2 The screening result of UV+LiCl treatment

图1 紫外照射对菌株致死率及正突变率的影响Fig.1 Effects of UV treatment on death rate and positivemutation rate

图2 紫外照射复合氯化锂对菌株致死率及正突变率的影响Fig.2 The effect of UV+LiCl treatment on death rate and positivemutation rate

2.3 紫外照射诱变的筛选结果

通过对米曲霉(ATCC20423)的孢子进行多次紫外照射诱变后，经初筛后共获得13株突变株，突变株在初筛小管中颜色变化情况和复筛测定结果见表1。相对出发菌株，这13株突变株的初筛小管颜色较深，其中突变株 UV-15-18、UV-15-20、UV-15-35、UV-15-37的初筛小管颜色加深最明显。从酶活力测定结果来看，13株突变株酶活力均比出发菌株增大。其中UV-15-20的增幅最大，比出发菌株提高了49.22%。

2.4 紫外照射复合氯化锂诱变的筛选结果

通过对米曲霉(ATCC20423)的孢子进行多次紫外照射复合氯化锂诱变后，经初筛后共获得14株突变株，突变株在初筛小管中颜色变化情况和复筛测定结果见表2。相对出发菌株，这14株突变株的初筛小管颜色较深，其中突变株UV-LiCl-27、UV-LiCl-34、UV-LiCl-38的初筛小管颜色加深最明显。从酶活力测定结果来看，14株突变株酶活力均比出发菌株增大。其中UV-LiCl-38的增幅最大，比出发菌株提高了58.82%。

2.5 突变株的遗传稳定性

对产乳糖酶活力高的突变株UV-15-20和UVLiCl-38连续传代8代，进行遗传稳定性实验，其结果见表3和表5，方差分析结果分别见表4和表6。

表4 突变株UV-15-20传代实验方差分析Table 4 Variance analysis of generation test ofmutant UV-15-20

由表3和表5可以看出，突变株UV-15-20不同代菌株酶活力变化范围为113.74～114.53U/m L，变化最大差值为0.79U/m L。突变株UV-LiCl-38不同代菌株酶活力变化范围120.97～121.99U/m L，变化最大差值为1.01U/m L。通过方差分析(表4和表6)可知，突变株UV-15-20、UV-LiCl-38乳糖酶活力组间差异的p值都大于0.05，说明传代次数对两个突变株乳糖酶活力变化影响不显著，表明突变株UV-15-20、UV-LiCl-38具有稳定的遗传性。

表3 突变株UV-15-20不同代次的乳糖酶活力(U/mL)Table 3 β-Galactosidase enzyme activity ofmutant UV-15-20 of different generation(U/mL)

表5 突变株UV-LiCl-38不同代次的乳糖酶活力(U/mL)Table 5 β-Galactosidase enzyme activity ofmutant UV-LiCl-38 of different generation(U/mL)

表6 突变株UV-LiCl-38传代实验方差分析Table 6 Variance analysis of generation test ofmutant UV-LiCl-38

2.6 出发菌株和突变株的产酶曲线

突变株与出发菌株的产酶曲线见图3。由图3可以看出，突变株 UV-15-20与出发菌株ATCC20423的发酵产酶曲线类似，发酵1.5d后酶活迅速增加，第6d达到产酶高峰，此时，ATCC20423、UV-15-20的酶活力分别为76.45、114.35U/mL，此后酶活力开始下降，在发酵过程中突变株UV-15-20的酶活力普遍高于出发菌株。在发酵过程中，突变株UV-LiCl-38从第5d开始，产酶速率增加较快，第6d酶活力为120.72U/m L，达到产酶高峰。

图 3 ATCC20423、UV-15-20和UV-LiCl-38的乳糖酶活力曲线Fig.3 Fermentation curve of lactase from ATCC20423、UV-15-20 and UV-LiCl-38

2.7 出发菌株和突变株的形态特征比较

将出发菌株ATCC20423和突变株UV-15-20、UV-LiCl-38点植于PDA培养基进行培养，30℃培养后，观察菌落形态、菌丝体颜色等。菌落形态如图4所示。培养2d后，可以观察到出发菌株和两株突变株菌落中央的菌丝顶部均长出少量绿色孢子。培养4d后，出发菌株的菌落直径为3.8cm，UV-15-20的菌落直径为3.2cm，UV-LiCl-38的菌落直径为4.5cm;出发菌株和突变株UV-15-20已经开始大量产生孢子，UV-LiCl-38产生的孢子量较少。培养6d后，整个菌落被绿色的孢子覆盖，菌落边缘均为白色菌丝，菌丝体呈白色，菌落质地绒毛状，菌落高度丘状隆起。

图4 ATCC20423、UV-15-20、UV-LiCl-38 的菌落形态Fig.4 The characteristics of colony of ATCC20423、UV-15-20、UV-LiCl-38

3 讨论

ONPG离心小管法有效地指导了本实验的复筛工作。目前，文献报道的有关乳糖酶产生菌的筛选方法主要有:X-gal平板法［13］、ONPG 孔板分离法［14］、ONPG离心小管法［15］。X-gal灵敏度高，会导致初筛工作量大且准确率低［16］;霉菌菌落较大，X-gal价格昂贵，采用平板分离法会加大平板的用量，同时也导致X-gal用量增加。孔板分离法和离心小管法以ONPG为产酶指示剂，与X-gal指示剂法相比，可以避免灵敏度和价格高的问题，孔板分离法易受小孔之间颜色互相干扰、菌株容易污染的影响，离心小管法采用离心小管作为培养小室可以解决污染，颜色干扰的问题［17］。

本实验将紫外线和氯化锂结合使用，诱变效果较好，其乳糖酶活力比出发菌株提高了58.82%，比使用紫外照射诱变获得的产乳糖酶能力增加幅度最大的突变株UV-15-20提高了9.6%。乳糖酶产量提高与多种因素有关，除了菌种自身的遗传改造外，发酵条件的优化对产酶也有重要的影响［18］。通过发酵培养基和发酵条件的优化来提高产酶量有待进一步研究。

4 结论

4.1 通过紫外照射对米曲霉进行诱变实验，确定了最佳紫外照射时间为15min;经紫外诱变后，筛选得到一株产乳糖酶能力增加幅度最大的突变株UV-15-20，乳糖酶活力为 114.08U/mL，比出发菌株提高了49.22%。

4.2 通过紫外线复合氯化锂对米曲霉进行诱变实验，确定了最佳紫外照射时间为15min，1.5%的LiCl溶液作为紫外复合氯化锂的促诱变剂，经紫外复合氯化锂诱变后，经筛选得到一株产乳糖酶能力增加幅度最大的突变株 UV-LiCl-38，乳糖酶活力为121.42U/mL，比出发菌株提高了58.82%。

4.3 对突变株UV-15-20和UV-LiCl-38进行遗传稳定性实验，结果表明菌株UV-15-20、UV-LiCl-38具有稳定的遗传性。

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