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乙酰肝素酶在人类自然流产过程中的作用研究

2013-12-08穆雅琴刘润花朱壮彦李拴明王艳红赵富玺

中国计划生育学杂志 2013年1期
关键词:滋养层胞外基质胚胎

穆雅琴 刘润花 朱壮彦 王 健 李拴明 王艳红 赵富玺

山西大同大学医学院免疫学研究所(037009)

自然流产的病因与患者自身的遗传、解剖、内分泌、免疫、感染等因素有关,但仍有部分原因不明[1],是生殖医学研究的难点。正常妊娠是一个成功的半同种移植过程,任何异常均可能导致流产的发生。胚泡成功植入子宫是妊娠建立的关键,但人类约75%胚胎不能成功植入,因而导致不孕、流产等的发生。深入了解与植入有关的分子机制,将有助于自然流产的预防和治疗。最近研究发现,乙酰肝素酶(HPSE)作为体内唯一的一种葡萄糖醛酸内切酶,可以降解子宫内膜的硫酸类肝素蛋白聚糖,破坏子宫内膜的细胞外基质和基底膜的结构和完整性;同时还可以释放一些细胞因子促进滋养层细胞侵入、血管生成和组织重建,有利于胚泡植入[2],但HPSE对人类自然流产的作用尚未见报道。鉴于此,本研究拟采用反转录PCR方法、Westen Blot方法,检测正常妊娠和自然流产妇女的流产绒毛组织中HPSE mRNA和蛋白表达,研究HPSE在人类正常妊娠、自然流产中作用。

1 材料和方法

1.1 标本来源

研究对象选自大同市医院2011~2012年门诊及住院者。随机选取非意愿性正常妊娠者流产绒毛组织15例为正常组,早期自然流产者流产绒毛组织20例为自然流产组。正常组孕妇年龄28.4±5.4岁,孕8.6±3.7周,B超证实胎儿发育正常,既往无不良妊娠史。自然流产组孕妇年龄27.5±3.9岁,孕8.9±2.5周。两组年龄、孕周差异无统计学意义。所有对象平素月经规则,近期未服用过激素类药物,均排除全身及生殖系统急、慢性感染。新鲜组织标本一部分经中性福尔马林固定、石蜡包埋成石蜡块;另一部分经液氮速冻后-80℃保存。本研究符合医学伦理学的相应要求,所有入组对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂

HPSE抗体购自以色列InSight生物制药公司。FITC标记的二抗购自北京中杉生物技术有限公司。RNA提取试剂 Trizol Reagent为Invitrogen公司产品。M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒、引物等均由上海生工生物工程有限公司提供。DNA合成酶由TAKARA公司生产。

1.3 方法

1.3.1 反转录PCR 按照Trizol提取RNA的说明进行RNA提取。提取的总RNA按照M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒、PCR试剂盒进行反转录和PCR扩增。HPSE扩增片段长180bp,正义引物为5'- CACAAACACTGACAATCCAAGG - 3';反义引物为 5'- CCATTGAGTTGGACAGATTTGG - 3'。内对照β-actin扩增片段长218bp,正义引物为5'-CAAAGACCTGTACGCCAACAC - 3';反义引物为 5'-ATACTCCTGCTTGCTGATCC -3'。取扩增产物3μl经2%琼脂糖凝胶电泳(含EB),紫外灯下观察。通过出现阳性条带的样本例数占所在组样本总例数的百分比分别计算正常组和自然流产组的HPSE mRNA阳性表达率。

1.3.2 Western Blot方法 取少量绒毛组织冰浴剪碎,匀浆,经细胞裂解液作用后提取标本总蛋白。紫外分光光度仪定量后经SDS-PAGE电泳,后硝酸纤维素膜转膜,经5%脱脂奶粉封闭后依次加入鼠抗人HPSE一抗过夜,TBST缓冲液洗膜3次后经辣根过氧化酶标的二抗孵育。经二氨基联苯胺显色后观察实验结果。采用已知的HPSE蛋白作为阳性对照。通过出现阳性条带的标本例数占所在组标本总例数的百分比分别计算正常组和自然流产组的HPSE蛋白的阳性表达率。

1.4 统计学方法

实验数据以阳性率(%)表示,采用SPSS17.0软件包进行χ2检验。

2 结果

2.1 HPSE mRNA 表达

2组所有标本β-actin mRNA均出现阳性扩增条带。通过反转录PCR发现,HPSE mRNA的阳性表达比例正常组(12/15)高于自然流产组(9/20)(χ2=4.375,P=0.036)。电泳结果见图 1。

图1 两组标本HPSE及β-actin PCR扩增产物电泳图

2.2 HPSE 蛋白表达

2组样本总蛋白经Western Blot出现清晰条带为HPSE蛋白表达阳性(图2)。HPSE蛋白表达的阳性比例正常组(11/15)高于自然流产组(7/20)(χ2=5.042,P=0.025)。

图2 两组标本总蛋白的Western Blot结果

3 讨论

胚泡在子宫内膜的植入过程开始于滋养层细胞和子宫内膜之间直接的细胞接触,而这一过程与细胞外基质重建有密切关系。在胚泡植入过程中,子宫基质细胞发生蜕膜化,同时滋养层细胞侵入,通过发挥类似肿瘤细胞浸润的特性,完成子宫细胞外基质改造和母体血管重建。而构成子宫细胞表面、细胞外基质和基底膜的重要组成部分之一就是乙酰肝素蛋白聚糖(HSPGs),它主要由一个核心蛋白和数个与之共价连接的线性硫酸乙酰肝素(HS)侧链组成。HS通过特殊的位点与基底膜和细胞外基质中的Ⅳ型胶原、纤粘连蛋白以及层粘连蛋白结合并相互作用,形成牢固的网状结构[3]。HPSE是目前发现的哺乳动物体内唯一能降解硫酸乙酰肝素蛋白多糖的β-D-葡萄糖醛酸内切酶,可识别HSPG侧链特异位点中的HS,将HS降解为10~20个糖单位大小的短糖链。该酶在许多组织和细胞中已被证实发现,其中包括胎盘、免疫细胞、细胞滋养层细胞和胚胎毛细血管的子宫内膜。目前对HPSE在妊娠过程的研究仅限于子宫内膜异位、葡萄胎、异位妊娠、胎盘植入、先兆子痫等[3,4],与复发性流产的研究未见报道。

本研究发现在正常妊娠者绒毛组织中HPSE的阳性表达比例较自然流产组高,其原因可能是在正常妊娠过程中,HPSE在绒毛组织中大量表达,通过裂解HS破坏细胞外基质和基底膜结构和完整性,降低其对子宫内膜的保护作用;同时在胚胎植入过程中,HPSE可裂解子宫内膜基底膜HSPGs中的HS,释放血管生长因子、促进滋养层细胞侵入、血管生成和组织重建,促进胚泡植入[5,6]。通过这些机制对血管生成产生影响,为胚胎组织的植入、生长、滋养层细胞的浸润和胎盘血管的形成奠定物质基础。有研究表明在转基因小鼠中,HPSE高表达可导致胚胎植入数量的大幅度增加[7]。而且在体外研究中发现,大量的HPSE可提高胚胎的植入数量、促进胚胎的生长[8]。在自然流产组中HPSE的阳性表达比例降低,因此本实验推测HPSE的表达低下可能是导致流产发生的原因之一。深入了解植入与胚胎生长的有关分子机制,将有助于进一步指导早期自然流产的治疗。

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3 Kim SH,Turnbull J.Guimond S.Extracellular matrix and cell signalling:the dynamic cooperation of integrin,proteoglycan and growth factor receptor[J].Endocrinol,2011,209(2):139 -151.

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7 Zcharia E,Metzger S,Chajek - Shaul T,et al.Transgenic expression of mammalian heparanase uncovers physiological functions of heparan sulfate in tissue morphogenesis,vascularization,and feeding behavior[J].Faseb J,2004,18(2):252 -263.

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